Die Regulation der prokaryontischen Transkription auf molekularer Ebene

Titelangaben

Prasch, Stefan Josef:
Die Regulation der prokaryontischen Transkription auf molekularer Ebene.
Bayreuth , 2008
( Dissertation, 2008 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

Volltext

	Format: PDF Name: prasch_diss.pdf Version: Veröffentlichte Version Verfügbar mit der Lizenz Creative Commons BY 3.0: Namensnennung
	Download (5MB)

Abstract

In Escherichia coli wird die RNA-Synthese durch eine aus fünf Untereinheiten bestehende RNA Polymerase (RNAP) katalysiert. Für die Bildung der Phosphodiesterbindung in der RNA sind die beta- und beta’-Untereinheiten verantwortlich. Die aminoterminalen Domänen der beiden alpha-Untereinheiten sind für den korrekten Aufbau zuständig, während die durch einen flexiblen Linker verbundenen carboxyterminalen Domänen (alphaCTD) regulatorische Aufgaben erfüllen. Die zuletzt entdeckte omega-Untereinheit fördert ebenso den Aufbau, ist aber für das Überleben von Escherichia coli nicht notwendig. Der Ablauf der Transkription wird begrifflich in die Initiation, Elongation und Termination eingeteilt. Bei der Initiation bindet ein so genannter sigma-Faktor an die RNAP. Das so entstandene Holoenzym erkennt den Promotor und startet die RNA-Synthese. Der sigma-Faktor verlässt die RNAP, es bildet sich der Transkriptionselongationskomplex, der zu einer stark gesteigerten RNA-Syntheserate führt. Im letzten Schritt erfolgt der Kettenabbruch, woraufhin freigewordene RNAP erneut einen Transkriptionszyklus starten kann. Eine zentrale Rolle bei der Regulation der Elongation und Termination spielt das essentielle NusA Protein (N utilization substance A), das im Verbund mit NusB, NusE und NusG, vor allem die Geschwindigkeit der RNA-Synthese steuert. Der Aufbau von NusA aus sechs Domänen spiegelt die vielfältigen Aufgaben des Proteins. Die aminoterminale Domäne vermittelt die Interaktion mit der RNAP. Die RNA-Bindungsregion wird durch die S1-, KH1- und KH2-Domänen aufgebaut. Die beiden carboxyterminalen acidic repeats AR1 und AR2 erfüllen jeweils unterschiedliche Aufgaben, die bisher nur zum Teil aufgeklärt sind und im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Eine weitere Rolle spielt NusA bei der Antitermination. Dieser zuerst im Phagen lambda entdeckte Mechanismus bewirkt, dass die Transkription nicht an einem Terminationssignal abbricht. Das dafür notwendige Antiterminationssignal besteht aus zwei bestimmten RNA-Sequenzabschnitten, boxA und boxB, die durch eine Trennsequenz miteinander verbunden sind. Während die boxA sowohl im Phagen lambda als auch in den für die ribosomale RNA codierenden Operons stark konserviert ist, weist die boxB in den beiden genannten Fällen nur geringe Gemeinsamkeiten auf. Das NusA Protein bindet an das Antiterminationssignal und an die RNAP. Die so veränderte RNAP ist nun in der Lage, stromabwärts gelegene Terminationssignale zu überlesen. In dieser Arbeit wurde zuerst die Rolle der AR1 Domäne untersucht. Eine bereits bekannte Kristallstruktur zeigt AR1 in Komplex mit lambda N. Jedoch fehlt in dieser Struktur die zweite Hälfte des lambda N Bindungsmotives (Aminosäurereste 42 bis 47), ebenso wie AR2, was zur Vermutung führte, dass diese Domäne lambda N(42-47) binden könne. Zur Klärung dieser Frage wurden die beiden Domänen AR1 und AR2 jeweils einzeln kloniert und im Hinblick auf ihre Bindung an das lambda N Protein getestet. In dieser Arbeit wurde eine ausschließliche Bindung von AR1 an lambda N gefunden, inklusive der in der Kristallstruktur fehlenden Aminosäurereste. Zusätzlich induziert AR1 bei der Bindung eine helikale Konformation im Bereich des Arginin-reichen Motives von lambda N (Aminosäurereste 1 bis 22), wodurch ein theoretisches Modell der lambda N Funktionsweise bestätigt wurde. Zudem wurde die Interaktion von NusA-AR2 charakterisiert. Biochemische Daten ließen auf eine Wechselwirkung von NusA mit alphaCTD schließen. Basierend darauf wurde in dieser Arbeit nachgewiesen, dass in diesem Fall ausschließlich AR2 für die Wechselwirkung mit alphaCTD verantwortlich ist. Mit Hilfe von NMR-Experimenten wurde im Anschluss daran die Komplexstruktur berechnet. Die resultierende Bindungsfläche seitens alphaCTD lieferte dabei Rückschlüsse, wie NusA möglicherweise die RNAP von der Initiations- in die Elongationsphase überführt. Ebenso erlaubten die neu gewonnenen Ergebnisse einen Vergleich der Bindungseigenschaften von AR1 und AR2. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Wechselwirkung von NusA mit dem Antiterminationssignal studiert. Dazu wurde eine NusA Deletionsmutante kloniert und gereinigt, die ausschließlich aus den bisher vermuteten RNA-Bindungsdomänen S1, KH1 und KH2 bestand. Anhand der gemessenen Fluoreszenzanisotropie-Daten wurde die Bindung im Bereich der Trennsequenz lokalisiert. Die schwächere Affinität des Phagen lambda Signals nutL und nutR im Vergleich zur ribosomalen RNA erklärt die Notwendigkeit des zusätzlichen Faktors lambda N im Phagen System.

Abstract in weiterer Sprache

RNA synthesis in Escherichia coli is catalyzed by RNA polymerase (RNAP), whose core consists of five subdomains, alpha2betabeta’omega. Whereas the beta and beta’ subunits catalyze RNA polymerization, the two alpha subunit N-terminal domains orchestrate RNAP assembly and the C-terminus of the alpha subunit (alphaCTD) forms an independent domain attached via an unstructured linker. The omega subunit is dispensable for cell viability, but may act as a chaperone and promote RNAP assembly in vitro. The transcription process is subdivided into initiation, elongation, and termination. During initiation a so called sigma-factor binds the RNAP. The holoenzym recognizes the promoter and thus enables the start of the transcription process. After sigma-factor release, the high processive transcription elongation complex is formed. At the end of transcription, chain elongation is interrupted and the released RNAP can restart a new transcription cycle. The essential NusA protein (N utilization substance A) together with the additional host factors NusB, NusE, and NusG modulates transcription pausing, termination, and antitermination. The multiple functionality of NusA is reflected by its multidomain structural organization. The N-terminal RNAP-binding domain is connected through a flexible hinge helix to the RNA binding interface that is composed of three domains, S1, KH1, and KH2. Finally, NusA has an additional C-terminal extension consisting of two so called acidic repeats AR1 and AR2. NusA plays also an important role in antitermination in the phage lambda/Escherichia coli system. This mechanism inhibits the termination of transcription at intrinsic and Rho-dependent termination signals. The necessary RNA based signal is composed of boxA and boxB, separated by a spacer. NusA together with auxiliary host factors binds the antitermination signal and alters RNAP to prevent transcription termination. For phage lambda antitermination, an additional lambda phage protein called lambda N is necessary. The aim of this work has been to elucidate different interactions of NusA within the antitermination complex. As a first step, the interaction of NusA AR1 and lambda N has been investigated. Heteronuclear NMR experiments with lambda N in complex with AR1 revealed that upon complex formation the lambda N-binding interface, residues 37 to 47, adopt a rigid structure similar to the known X-ray structure. As the second parts of the lambda N-binding interface, residues 42 to 47 as well as AR2 are missing in the X-ray structure, this work intended to clarify their role in the antitermination complex. From titration experiments it could be shown that AR2 is not part of the lambda N-NusA complex. Furthermore, the missing residues of lambda N also interact with AR1. Moreover, upon binding of NusA induction of a weak helical structure in the lambda N boxB RNA-binding region, residues 1 to 22, could be demonstrated, in agreement with one of the theoretical models of lambda N action. Furthermore, interactions of the second acidic repeat, AR2, with NusA were studied. From biochemical data an interaction of the C-terminal part of NusA with alphaCTD had been proposed. Here we could demonstrate that only AR2 is involved in this complex. Subsequently, the complex structure has been determined using NMR-techniques. AR2 blocks the “265 determinant” on alphaCTD which is known to mediate the interaction with an important initiation regulatory element, the upstream activating element. Based on these results, the interplay between AR2 and alphaCTD could displace this element, suggesting the NusA-alphaCTD interaction to be a key switch from initiation to elongation. Finally, this work describes in quantitative terms the interaction of NusA with antitermination signals composed of a boxA and boxB separated by a spacer. Isotropic and anisotropic fluorescence equilibrium titration revealed that the RNA binding site for NusA is located in the spacer. The lower affinity for the phage lambda antitermination signals nutL and nutR compared to the ribosomal signal in the rrn Operon explains the necessity of the auxiliary factor lambda N.