From intracellular recording to structural analysis – new approaches on the mode of action of anthropogenic chemicals

Titelangaben

Schirmer, Elisabeth:
From intracellular recording to structural analysis – new approaches on the mode of action of anthropogenic chemicals.
Bayreuth , 2022 . - 105 S.
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Despite their many benefits, anthropogenic chemicals also pose potential threats to human and animal health. They can potentially act on various levels of organization – from molecular level, affecting the lipid composition to neuronal key functions, affecting synaptic information transmission and circuit function. However, methods providing comprehensive and, in particular, quick information about the mode of action of anthropogenic chemicals are rare. In this thesis I first focus on functional effects of anthropogenic chemicals on neuronal function. I present the goldfish’s Mauthner neuron, a giant central command neuron, which is individually identifiable from one animal to the next and accessible for intracellular in vivo recording, as a new model to obtain quick and comprehensive information on key aspects of neuronal and circuit function. In this context, I initially present how recording in the Mauthner cell can quickly and systematically help filling the gap that currently exists between the legislation of many countries and informed decision-making on anaesthetic use in ectothermic vertebrates. The pair of Mauthner cells has a crucial role in triggering one of the most studied behavioural responses, the vital escape start in teleost fish. To fulfil this role, the Mauthner neurons need to integrate and process information from all sensory systems. This allows to directly and efficiently assay specific effects of anaesthetic agents on central processing and sensory information transmission. Concentration-effect curves further enable the informed decision-making if and at which concentration a given anaesthetic affects neuronal function. I applied the method to four chemicals commonly used as equivalently anaesthetics in fish. I demonstrate that this approach allows to rapidly obtain comprehensive and reliable information with a small number of animals, emphasizing these experiments also from an ethical point of view. These findings provide the basis for an equally informed decision-making on the anaesthetic use in fish, comparable to what is standard since the last 50 years in higher vertebrates. This is the first step in fulfilling the demands by present legislation, which demands the application of anaesthetic agents for any intervention that could be stressful for all vertebrates. I further present the unique opportunity to use the Mauthner neuron as a new model to assay the impact of anthropogenic chemicals on neuronal function, by revealing the alarming and uncompensated impact of one month of exposure to two plasticizers (bisphenol A and its substitute bisphenol S) on basically every neuronal property. Due to the broad range of application of these plasticizers they are annually released at rates of hundreds of tons into the biosphere, which makes them already ubiquitously present in the environment. Beside their proven effect to act as xeno-estrogens, recent studies also demonstrate effects on juvenile developing brains. However, for both bisphenols, the impact on the intact adult brain, whose powerful homeostatic mechanisms could potentially compensate any effects bisphenols might have on isolated neurons, is completely unknown. Using recording in the Mauthner neuron, I could reveal similar effects of both bisphenols, which strongly affect all basic aspects of neuronal function, and additionally show that these effects occur even at low, environmentally relevant concentrations. Comparable effects on neuronal function observed after exposure of EE2 (ethinyl estradiol), indicate that the examined effects after bisphenol exposition could at least partly occur due to the activation of estrogen receptors. The observed dramatic impact on the mature brain is not only worrying for aquatic organisms, but also for human health. It has been shown that offsetting balance in the brain might be the basis of severe neurological disorders. Hence, I call for the rapid replacement of both plasticizers and recommend this assay, due to its speed and resolution, to be part of early testing phases for new developed plasticizers. In the third chapter of this thesis, I address the lipid composition within two aquatic model organisms (zebrafish and water flea). I demonstrate the capacity of MALDI MSI, an analytical imaging technique being able to identify lipids and visualise their spatial distribution within thin tissue sections, by providing highly resolved histology-linked lipid pattern even down to subcellular resolution. This could serve as a basis for future studies assaying molecular changes caused by anthropogenic chemicals. Using this analytical approach, I could not only visualise the anatomical arrangement of different organs due to their lipid content in the analysed tissue section, but, in the case of zebrafish, additionally provide a deeper insight into characteristic features like different eye layers, brain regions and neuronal structures (e.g. axon of the Mauthner neuron). In summary, I present groundbreaking findings by assaying the impact of anthropogenic chemicals on neuronal and molecular level. Those approaches open up new possibilities for the risk assessment of anthropogenic chemicals.

Abstract in weiterer Sprache

Trotz ihrer vielen Vorteile stellen anthropogene Chemikalien auch eine potenzielle Bedrohung für die Gesundheit von Menschen und Tieren dar. Sie können potenziell auf verschiedenen Organisationsebenen wirken – von der molekularen Ebene, durch Beeinträchtigung der Lipidzusammensetzung, bis hin zu zentralen neuronalen Funktionen, durch den Einfluss auf die synaptische Übertragung von Information und die neuronale Interaktion in funktionellen neuronalen Netzwerken. Methoden, die umfassend und vor allem schnell Informationen über die Wirkungsweise anthropogener Chemikalien geben, sind jedoch selten. In dieser Arbeit konzentriere ich mich zunächst auf funktionelle Effekte hervorgerufen durch anthropogene Chemikalien auf die neuronale Funktionalität. Dabei stelle ich die Mauthner-Zelle des Goldfisches, ein riesiges zentrales Kommandoneuron, welches individuell von einem Tier zum nächsten identifizierbar und für intrazelluläre in vivo-Ableitungen zugänglich ist, als ein neues Modell vor. Dieses ermöglicht schnell umfassende Informationen bezüglich zentraler neuronaler Funktionalität und Netzwerkfunktion zu erhalten. In diesem Zusammenhang stelle ich zunächst vor, wie Ableitungen in der Mauthner-Zelle schnell und systematisch dazu beitragen können, die Lücke zu schließen, die derzeit zwischen dem tatsächlichen Einsatz von Anästhetika bei ektothermen Wirbeltieren und den Vorgaben des Tierschutzgesetzes vieler Länder besteht. Das Mauthner-Zell-Paar ist entscheidend für die Ausführung einer der am besten untersuchtesten Verhaltensreaktionen, dem lebensrettenden Fluchtstart der Knochenfische. Um diese Aufgabe zu erfüllen, müssen die Mauthner-Neurone Informationen aus allen sensorischen Systemen integrieren und verarbeiten. Dies ermöglicht die direkte und effiziente Untersuchung spezifischer Effekte von Anästhetika auf die zentrale V erarbeitung sensorischer Information und die sensorische Informationsübertragung. Konzentrations-Wirkungskurven ermöglichen darüber hinaus die fundierte Entscheidung, ob und bei welcher Konzentration ein bestimmtes Anästhetikum neuronale Funktionen beeinflusst. Ich habe die Methode auf vier Chemikalien angewandt, die üblicherweise als gleichwertige Anästhetika bei Fischen eingesetzt werden und zeige, dass mein Versuchsdesign schnell eine umfassende und zuverlässige Informationsgewinnung anhand einer kleinen Versuchstieranzahl ermöglicht, was diese Experimente auch unter ethischen Gesichtspunkten interessant macht. Die Ergebnisse dieser Studie bilden die Grundlage für einen Einsatz von Anästhetika bei Fischen, der vergleichbar ist mit dem, was bei höheren Wirbeltieren seit über 50 Jahren Standard ist. Dies ist ein erster Schritt zur Erfüllung der Forderungen der gegenwärtigen Gesetzgebung, die den auf den jeweiligen Eingriff abgestimmten Einsatz von Narkosemitteln für alle Wirbeltiere verlangt. Darüber hinaus präsentiere ich hier die Möglichkeit, das Mauthner-Neuron als Modell zur Bestimmung von Effekten anthropogener Chemikalien auf die neuronale Funktionalität zu verwenden, indem ich die alarmierenden und nicht kompensierten Auswirkungen einer einmonatigen Exposition gegenüber zwei Weichmachern (Bisphenol A und sein Ersatzstoff Bisphenol S) auf praktisch alle neuronalen Eigenschaften aufzeige. Weichmacher werden aufgrund des breiten Anwendungsspektrums jährlich in Mengen von Hunderten von Tonnen in die Biosphäre freigesetzt, wodurch sie bereits ubiquitär in der Umwelt vorhanden sind. Neben der nachgewiesenen Wirkung von Bisphenolen als Xeno-Östrogene, zeigen Studien auch Effekte auf sich entwickelnde Gehirne. Wirkungen auf das adulte Gehirn, dessen leistungsfähige homöostatische Mechanismen potenziell alle Effekte, die Bisphenole auf isolierte Neurone ausüben, kompensieren könnten, waren jedoch für beide Bisphenole bisher nicht bekannt. Durch Ableitungen im Mauthner-Neuron konnte ich ähnliche Effekte beider Bisphenole auf die neuronale Funktionalität aufzeigen. Zusätzlich konnte ich zeigen, dass diese Effekte schon bei niedrigen, umweltrelevanten Konzentrationen auftreten. Vergleichbare Effekte auf die neuronale Funktionalität nach Exposition mit EE2 (Ethinylestradiol) deuten darauf hin, dass die nach Bisphenol-Exposition beobachteten Effekte zumindest teilweise durch Aktivierung von Östrogen-Rezeptoren auftreten könnten. Die beobachteten dramatischen Auswirkungen auf das adulte Gehirn sind jedoch nicht nur für aquatische Organismen besorgniserregend, sondern betreffen auch die menschliche Gesundheit. Eine Störung der Homöostase im Gehirn kann die Grundlage für schwere neurologische Erkrankungen sein. Daher plädiere ich für das schnelle Ersetzen beider Weichmacher und empfehle die hier verwendete Methode aufgrund ihrer Schnelligkeit und der detaillierten Informationen, die diese in der Lage ist zu liefern, in der frühen Testphase für neu entwickelte Weichmacher einzusetzen. Im dritten Kapitel dieser Arbeit beschäftige ich mich mit der Lipidzusammensetzung in zwei aquatischen Modellorganismen (Zebrafisch und Wasserfloh). Ich demonstriere die Fähigkeit von MALDI MSI, einem analytischen Bildgebungsverfahren, das die Identifizierung von Lipiden und ihre räumliche Verteilung in dünnen Gewebeschnitten ermöglicht, anhand hochaufgelöster Histologie-bezogener Lipidmuster, die sich bis hin zu subzellulärer Auflösung erstreckt. Dies könnte als Grundlage für zukünftige Studien dienen, in denen molekulare Veränderungen, hervorgerufen durch anthropogene Chemikalien, untersucht werden. Mit diesem analytischen Ansatz konnte ich nicht nur die anatomische Anordnung verschiedener Organe aufgrund ihres Lipidgehalts im analysierten Gewebeschnitt sichtbar machen, sondern im Falle des Zebrafisches zusätzlich einen tieferen Einblick in charakteristische Merkmale wie verschiedene Augenschichten, Hirnregionen und Bestandteile einzelner Neurone (z.B. Axon und Soma des Mauthner-Neurons) geben. Zusammenfassend stelle ich bahnbrechende Erkenntnisse über die Effekte von anthropogenen Chemikalien auf neuronaler und molekularer Ebene vor. Die hier vorgestellten Ansätze eröffnen darüber hinaus neue Möglichkeiten in der Risikobewertung anthropogener Chemikalien.