NusA – zentraler Interaktionspartner in Antiterminationsprozessen in Escherichia coli und des Phagen λ

Titelangaben

Dudenhöffer, Benjamin R.:
NusA – zentraler Interaktionspartner in Antiterminationsprozessen in Escherichia coli und des Phagen λ.
Bayreuth , 2025 . - VI, 165 S.
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Transcription, the synthesis of ribonucleic acid (RNA) based on a deoxyribonucleic acid (DNA) template, is catalyzed by DNA-dependent RNA polymerases (RNAPs) the simplest bacterial representatives of which are composed of five subunits (2xα, β, β, ω). In all steps of the transcription cycle (initiation, elongation, termination) RNAP activity is regulated by a multitude of transcription factors (TFs), such as the bacterial N-utilization substances (Nus)-factors A, B, E and G. Escherichia coli (E. coli) NusA consists of six domains: a N-terminal domain (NTD), an S1 domain which forms together with the two following K homology (KH) domains KH1 and KH2 the RNA-binding SKK unit, as well as two C-terminal acidic repeat domains (AR1, AR2). Formation of an intramolecular complex of NusA-AR2 with NusA-KH1 prevents RNA binding by NusA-SKK, thus autoinhibiting NusA. This autoinhibition can be released by the interaction of NusA-AR2 with the C-terminal domain of the α-subunit of RNAP (RNAPαCTD). Furthermore, the NusA-AR2:RNAPαCTD interaction, together with the binding of NusA-NTD to the second RNAPαCTD and the β flap-tip helix (βFTH) located at the RNA exit channel of RNAP, mediates the binding of NusA to RNAP. NusA contacts RNAP throughout elongation and, depending on the context, exerts partially contrary effects. For example, NusA, together with other Nus factors and other components, is able to suppress termination sequences, a mechanism known as antitermination (AT), which was the subject of this work. In E. coli the expression of ribosomal RNA genes is regulated by AT (rrn-AT). Nus factors are recruited to the RNAP by a specific RNA sequence and form together with the RNAP and ribosomal protein S4 an rrn-AT complex which allows the read-through of Rho-dependent terminators. In addition, it has been postulated that the inositol monophosphatase SuhB was also involved in rrn-AT. Thus, the role of SuhB in rrn-AT was studied in this work by a combination of biochemical and nuclear magnetic resonance (NMR)-spectroscopic methods. It was shown that SuhB is integrated into an rrn-AT complex paused at an rrn-AT sequence, consisting of the RNAP, a nucleic acid scaffold, the Nus factors and optionally S4. Moreover, a direct interaction between SuhB and NusA-AR2 was demonstrated. Using this interaction, SuhB is able to release NusA autoinhibition or disrupt the NusA-AR2:RNAPαCTD interaction. Our results suggest that binding of SuhB to NusA-AR2 may play a role in the recruitment of SuhB to the rrn-AT complex, and could also facilitate binding of NusA-SKK to the rrn-AT sequence and induce repositioning of NusA at the RNAP. Nus factors are also involved in the two AT mechanisms of phage λ, which are required to replicate the phage’s genome in the host bacterium E. coli and which are mediated by the proteins λN and λQ, respectively. In λN-AT all Nus factors act together with λN to modify RNAP into a termination-resistant state, whereas in λQ-AT only a role for NusA has been postulated. In this thesis the structural basics of λQ-AT as well as the role of NusA was investigated by NMR spectroscopy. The binding of λQ to the βFTH of RNAP was structurally characterized and it was shown that NusA contacts λQ via its NTD and AR2 domain, although simultaneous binding of one λQ molecule to both NusA domains is not possible. Similar to SuhB, λQ is able to release the autoinhibition of NusA by interacting with NusA-AR2. Furthermore, λQ interacts with the βFTH, displacing NusA-NTD from it, triggering repositioning of NusA-NTD on the RNAP. λQ induced repositioning of NusA-NTD could lead to the AT-promoting effect of NusA, whereas the release of autoinhibition by λQ could trigger RNA binding by NusA-SKK and therefore recruitment of NusA to the λQ-AT complex. Moreover, the NusA-AR2:λQ-interaction may be involved in the recruitment of λQ. Finally, it was shown that, in high molar excess, λQ can disrupt binding of NusA-NTD and NusA-AR2 to the RNAPαCTD, which might induce the dissociation of NusA from RNAP. The results of this work underline the central role of NusA in the regulation of bacterial transcription. During transcription NusA is bound to RNAP via its NTD, whereas NusA-AR2, as shown in this work, can interact specifically with various TFs, suggesting that this domain may serve as versatile recruitment platform. Depending on the context the recruited TFs could, as shown for λQ, reposition NusA which, in turn, might result in a modulation of NusA effects on transcription.

Abstract in weiterer Sprache

Die Transkription, die Synthese von Ribonukleinsäure (RNA) basierend auf einer Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Matrize, wird durch DNA abhängige RNA-Polymerasen (RNAPs) katalysiert, deren einfachsten bakteriellen Vertreter aus fünf Untereinheiten (2xα, β, β, ω) aufgebaut sind. Die Aktivität der RNAP wird in allen Phasen des Transkriptionszyklus (Initiation, Elongation, Termination) durch eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren (TFs) reguliert, wie z. B. die bakteriellen N utilization substances (Nus)-Faktoren A, B, E und G. Escherichia coli (E. coli) NusA besteht aus sechs Domänen: einer N terminalen Domäne (NTD), einer S1-Domäne, die zusammen mit den zwei folgenden K homology (KH)-Domänen KH1 und KH2 die RNA-bindende SKK-Einheit bildet sowie zwei C terminalen acidic repeat (AR)-Domänen (AR1, AR2). Die RNA-Bindung von NusA wird durch die Bildung eines intramolekularen Komplexes von NusA AR2 mit NusA KH1 unterbunden, wodurch NusA autoinhibiert wird. Diese Autoinhibition kann durch die Interaktion von NusA AR2 mit der C terminalen Domäne der α Untereinheit der RNAP (RNAPαCTD) aufgehoben werden. Des Weiteren vermittelt die NusA AR2:RNAPαCTD-Wechselwirkung zusammen mit der Bindung von NusA-NTD an die zweite RNAPαCTD und die am RNA-Ausgangskanal der RNAP liegende β flap-tip-Helix (βFTH) die Bindung von NusA an die RNAP. NusA interagiert während der Elongation mit der RNAP und übt, kontextabhängig, teils konträre Effekte aus. So ist NusA z. B. in der Lage gemeinsam mit den anderen Nus-Faktoren und weiteren Komponenten das Überlesen von Terminationssequenzen zu vermitteln, ein Mechanismus, der als Antitermination (AT) bezeichnet wird und Forschungsgegenstand dieser Arbeit war. In E. coli ist die Expression ribosomaler RNA-Gene durch AT reguliert (rrn AT). Hierbei werden die Nus-Faktoren durch eine RNA-Sequenz an die RNAP rekrutiert und bilden zusammen mit dieser und dem Protein S4 einen rrn-AT-Komplex, welcher das Überlesen von Rho-abhängigen Terminatoren ermöglicht. Darüber hinaus wurde eine Beteiligung der Inositolmonophosphatase SuhB postuliert, weshalb die Rolle von SuhB bei der rrn-AT im Rahmen dieser Arbeit mit biochemischen und nuclear magnetic resonance (NMR)-spektroskopischen Methoden charakterisiert wurde. Es wurde gezeigt, dass SuhB in den an einer rrn-AT-Sequenz pausierten rrn AT Komplex – bestehend aus der RNAP, einem Nukleinsäuregerüst, den Nus-Faktoren sowie optional S4 – integriert wird und spezifisch mit NusA AR2 interagiert. Durch die Wechselwirkung mit NusA-AR2 kann SuhB außerdem die Autoinhibition von NusA aufheben bzw. die NusA-AR2:RNAPαCTD-Bindung auflösen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die SuhB:NusA-AR2-Interaktion bei der Rekrutierung von SuhB an den rrn AT-Komplex eine Rolle spielt sowie die Bindung der SKK Einheit an die rrn-AT-Sequenz erleichtern und eine Repositionierung von NusA an der RNAP induzieren könnte. Die Nus-Faktoren sind auch an den beiden, durch die Proteine λN bzw. λQ vermittelten, AT Mechanismen des Phagen λ beteiligt, welche zur Replikation des Phagen-Genoms im Wirtsbakterium E. coli dienen. Während in der λN-AT alle Nus-Faktoren zusammen mit λN die RNAP in einen terminationsresistenten Zustand versetzen, ist für die λQ-AT nur eine Beteiligung von NusA postuliert. In dieser Arbeit wurden die strukturellen Grundlagen der λQ-AT sowie die Rolle von NusA in dieser mittels NMR-Spektroskopie untersucht. Es wurde die Bindung von λQ an die βFTH der RNAP strukturell charakterisiert und gezeigt, dass NusA λQ mittels seiner NTD und AR2-Domäne kontaktiert, wobei keine simultane Bindung eines λQ-Moleküls an beide NusA-Domänen möglich ist. λQ ist darüber hinaus in der Lage durch die Interaktion mit NusA AR2 die Autoinhibition von NusA aufzuheben sowie durch die Wechselwirkung mit der βFTH NusA-NTD von dieser zu verdrängen und damit an der RNAP zu repositionieren. Die durch λQ induzierte Repositionierung von NusA NTD könnte zu dem AT-fördernden Effekt von NusA führen, während die Aufhebung der Autoinhibition durch λQ die RNA Bindung der SKK Einheit – und damit die Rekrutierung von NusA an den λQ-AT-Komplex – erleichtern könnte. Des Weiteren könnte die NusA-AR2:λQ-Interaktion auch der Rekrutierung von λQ dienen. Schließlich wurde gezeigt, dass λQ in hohem molaren Überschuss die Bindung von NusA NTD bzw. NusA-AR2 an die jeweilige RNAPαCTD auflöst, wodurch die Dissoziation von NusA von der RNAP induziert werden könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die zentrale Rolle von NusA in der Regulation der bakteriellen Transkription. NusA ist während dieser über seine NTD an die RNAP gebunden, während NusA-AR2, wie u.a. in dieser Arbeit gezeigt, spezifische Interaktionen mit TFs eingehen kann, was eine Funktion dieser Domäne als multifunktionale Rekrutierungsplattform nahelegt. Die rekrutierten TFs könnten, wie für λQ gezeigt, kontextabhängig NusA repositionieren, was wiederum mit einer Modulation der von NusA ausgeübten Effekte auf die Transkription einhergehen könnte.