Physiologische Charakterisierung und molekulare Analyse von Zink hypersensitiven Arabidopsis thaliana Mutanten

Titelangaben

Nagler, Nicole:
Physiologische Charakterisierung und molekulare Analyse von Zink hypersensitiven Arabidopsis thaliana Mutanten.
Bayreuth , 2021 . - 179 S.
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Zink ist sowohl für den Menschen als auch für Pflanzen ein essenzielles Schwermetall. Dabei kommt es aber vor allem auf die richtige Konzentration an. Zu hohe, aber auch zu geringe Mengen an Zink können sich negativ auswirken. Da Pflanzen sessile Organismen sind, müssen sie sich an fluktuierende Zink-Konzentrationen in ihrer Umgebung anpassen können. Um zu verstehen, wie dies funktioniert, ist es wichtig die Zink-Homöostase aufzuklären. Dabei soll nicht nur herausgefunden werden, wie die Zink-Konzentration innerhalb der Pflanze optimal gehalten werden kann, sondern auch welche zellulären Funktionen Zink ausübt. Bisher sind einige Aspekte der Zink-Homöostase bekannt, dennoch gibt es noch immer viele offene Fragen. Deshalb wurde hier mittels Zink-hypersensitiver ozs (overly zinc sensitive)-Mutanten an der Aufdeckung weiterer Mechanismen und Bestandteile der Zink-Homöostase gearbeitet. Eine dieser ozs-Mutanten weist eine Mutation in ACD5 (Accelerated cell death5) auf. Mit Hilfe dieser Mutante konnte eine Verbindung zwischen dem Sphingolipid-Stoffwechsel und der Zink-Toleranz aufgezeigt werden. Durch die Mutation kommt es in acd5-1 (bereits beschriebene Mutante; Greenberg et al. 2000) zur Akkumulation von Ceramiden, was unter Zink-Stress wahrscheinlich zu einer Reduktion der Fitness führt. Mittels RNA-Seq-Analyse konnte zum einen gezeigt werden, dass Zink-Stress einen Eisen-Mangel auslöst, wodurch höchstwahrscheinlich die Expression von Hypoxie-responsiven Genen induziert wird. Zum anderen konnte in acd5-2 (ozs11) unter Zink-Stress eine stark erhöhte ZAT7-Expression beobachtet werden. Eventuell wird die ZAT7-Expression durch verringerte Cer1P (Ceramid-1-Phosphat)-Konzentrationen zusammen mit erhöhten SA (Salicylsäure)-Gehalten unter Zink-Stress induziert. Eine weitere Zink-hypersensitive Mutante ist ozs3. Hier liegt die Mutation in einem Protein mit WD40-Domäne. Die Interaktion von OZS3 mit DDB1a wurde mittels Co-Immunopräzipitation nachgewiesen. Dadurch wurde die Hypothese gestützt, dass OZS3 als Substratrezeptor in einem CUL4-E3-Ligase-Komplex dient. Durch CRISPR/Cas9 konnte zudem gezeigt werden, dass OZS3 ein essenzielles Gen ist. Die genaue Funktion von OZS3 und die Verbindung zur Zink-Homöstase konnte bisher noch nicht geklärt werden. Eine Hypothese ist, dass es an der DNA-Reparatur beteiligt ist. Sollte ein Zink-Überschuss zu DNA-Schäden führen, könnten diese durch OZS3 repariert werden. Die dritte untersuchte Mutante war ozs1. Hier wurde mittels Suppressorscreen versucht, neue Erkenntnisse der Zink-Homöostase zu erlangen. Es konnte eine Mutante Suppressor of ozs1 1 (suo1) gefunden werden, welche ein signifikant besseres Wurzelwachstum als ozs1 unter Zink-Stress zeigte. Der Zink-Gehalt und die Verteilung war im Vergleich zu ozs1 in dieser Mutante sowohl in Keimlingen als auch in adulten Pflanzen unverändert. Mittels QTL (Quantitative Trait Locus)-Seq-Methode konnten mehrere mögliche Mutationen gefunden werden, welche für die gesteigerte Zink-Toleranzverantwortlich sein könnten. Die wahrscheinlichste Ursache ist die Mutation in ACA11 (Autoinhibited Ca2+-ATPase 11). ACA11 ist ein Ca2+-Transporter und transportiert Ca2+ vom Cytosol in die Vakuole. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass es in suo1 zu einer verstärkten und verlängerten Erhöhung der cytosolischen Ca2+-Konzentration kommt, wodurch die Zink-Toleranz erhöht wird.

Abstract in weiterer Sprache

Zinc is an essential heavy metal for humans as well as for plants. Especially the correct concentration is important. Too high but also too low zinc contents could lead to negative effects. Because plants are sessile organisms, they have to adapt to fluctuating zinc concentrations of their environment. To understand how this could function it is important to understand the zinc homeostasis. It should be uncovered how the zinc concentration could kept constant in the plant and which cellular functions zinc carries out. Until now some aspects of the zinc homeostasis are known, but there are still a lot of open questions. That is why we work with zinc hypersensitive ozs (overly zinc sensitive) mutants to uncover further mechanisms and components of the zinc homeostasis. One of these mutants carries a mutation in ACD5 (Accelerated cell death5). With this mutant a link between sphingolipide metabolism and zinc tolerance could be established. The mutation causes in acd5-1 (already described mutant; Greenberg et al. 2000) the accumulation of ceramids. This leads to a reduced fitness under zinc stress. Using an RNA-Seq analysis, it could be shown that on the one hand zinc stress causes iron deficiency. Most likely of this the expression of hypoxia responsive genes is induced. On the other hand, a strongly increased ZAT7 expression was observed in acd5-2 (ozs11) under zinc stress. Eventuelly the ZAT7 expression is caused by decreased Cer1P (Ceramide-1-phosphate) concentrations together with increased SA-levels under zinc stress. Another zinc hypersensitive mutant is ozs3. The mutation is located in a protein with a WD40 domain. The interaction between OZS3 and DDB1a was shown by CoIP. This confirms the hypothesis, that OZS3 works as substrate receptor in a CUL4 E3 ligase complex. By using CRISPR/Cas9 it was shown, that OZS3 is an essential gene. The exact function of OZS3 and the link to the zinc homeostasis is yet unclear. A hypothesis would be, that it is part of a DNA repair mechanism. If a zinc excess leads to DNA damage OZS3 could be involved in repairing it. The third project was ozs1. With the help of a suppressor screen we tried to gain new insights into zinc homeostasis. A mutant suo1 could be found, which shows a significant better root growth under zinc stress then ozs1. The zinc content and distribution in seedlings and adult plants of this mutant was the same as in ozs1. By using a QTL (Quantitative Trait Locus) Seq method, some mutations, which could be responsible for the increased zinc tolerance, could be identified. The most likely cause is the mutation in ACA11 (Autoinhibited Ca2+-ATPase 11). ACA11 is a Ca2+ transporter and transports Ca2+ from the cytosol into the vacuole. The hypothesis is that the magnitude and duration of cytosolic Ca2+ elevation is stronger and longer in suo1. This could increase the zinc tolerance.