Charakterisierung der anaeroben Gärung verschiedener Ausgangssubstrate mittels 16S rRNA Gen Amplikonsequenzierung und Metaproteomanalytik

Titelangaben

Büttner, Christian:
Charakterisierung der anaeroben Gärung verschiedener Ausgangssubstrate mittels 16S rRNA Gen Amplikonsequenzierung und Metaproteomanalytik.
Bayreuth , 2021 . - XVI, 183 S., 1 CD
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Biogas wird beim mikrobiellen, anaeroben Abbau von organischem Material gebildet. Der Einsatz von Biogas als Energieträger kann wesentlich zur reduzierten Nutzung von fossilen Energieträgern beitragen. Für die in Zukunft angestrebte Prozessflexibilisierung und –optimierung in Biogas- und Kläranlagen ist ein tiefes Verständnis der mikrobiellen Zusammensetzung und der mikrobiellen Interaktionsmuster während der anaeroben Gärung (AD) von großer Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften von 16 Biogas- (BPs) und zehn Kläranlagen (STPs) mittels 16S rRNA Gen Amplikonsequenzierung untersucht. Mittels Metaproteomanalysen wurden zusätzlich die 16 BPs taxonomisch und funktionell charakterisiert. Die mikrobiellen Gemeinschaften in STPs waren durch eine im Vergleich zu den BPs signifikant höhere Diversität und Evenness charakterisiert. Für beide Anlagentypen wurden bakterielle und archaelle Kernmikrobiome gebildet, welche die operativen taxonomischen Einheiten (OTUs) beinhalteten, die in allen Anlagen des jeweiligen Anlagentyps präsent waren. Das bakterielle Kernmikrobiom von BPs umfasste knapp 20 % aller OTUs, die einen Anteil von ca. 94 % an der mittleren Gesamtabundanz hatten. Hohe Abundanzen wurden dabei v.a. für Mitglieder der bisher unkultivierten Ordnungen MBA08, SHA-98 und die Familie Thermotogaceae beobachtet. In STPs waren ca. 33 % der OTUs Teil des Kernmikrobioms, das knapp 70 % der mittleren relativen Abundanz erklärte und von Mitgliedern der Familien Cloacamonaceae, Anaerolinaceae und der Ordnung Burkholderiales dominiert wurde. Die archaellen Kernmikrobiome bildeten in BPs sechs OTUs und in STPs zehn OTUs, die einen Anteil an der archaellen Gesamtabundanz von jeweils knapp 50 % abdeckten. Während in BPs die Familie Methanomicrobiaceae das archaelle Kernmikrobiom dominierte, wurden in STPs hohe Abundanzen für Methanobacteriaceae und die bisher unkultivierte Familie WSA2 beobachtet. Korrespondenzanalysen bestätigten eine höhere Diversität und Varianz innerhalb der bakteriellen und archaellen Gemeinschaften in STPs. Mittels kanonischer Korrespondenzanalyse wurde gezeigt, dass in BPs die Parameter pH und Temperatur einen signifikanten Einfluss auf die Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaft hatten, wohingegen in STPs für keinen Parameter ein signifikanter Einfluss nachgewiesen werden konnte. Die Zusammensetzung der archaellen Gemeinschaft wurde in BPs signifikant durch die Substratanteile von Rindergülle und Getreide beeinflusst, in STPs hingegen durch den pH-Wert. Auf Basis der relativen Abundanzen wurden mit dem Algorithmus MENA für beide Anlagentypen mikrobielle Netzwerke berechnet, wobei das STP-Netzwerk eine komplexere Netzwerkstruktur hatte. Die überwiegende Mehrheit der mikrobiellen Interaktionsmuster war für einen Anlagentyp spezifisch. Anhand ihrer Topologie konnten in BPs knapp 20 % der OTUs den Generalisten zugeordnet werden, wohingegen dies in STPs für 4 % der Fall war. Auffällig war weiterhin die hohe Zahl an archaellen OTUs innerhalb der Generalisten im BP-Netzwerk. Bei den Metaproteomanalysen wurden Proteine für alle wichtigen Stoffwechselprozesse der AD detektiert. Dabei waren Proteine der Methanogenese, Glykolyse und des Substratumsatzes sowohl bei der absoluten Häufigkeit, als auch bei den relativen Abundanzen dominant. Diese Proteine wurden taxonomisch überwiegend den Phyla Euryarcheota, Firmicutes, Proteobacteria und Bacteroidetes zugeordnet. Die funktionelle Zuordnung der Proteine zu den verschiedenen Methanogenesewegen erlaubte eine Einteilung der Anlagen hinsichtlich ihres wahrscheinlich dominierenden Methanogenesewegs in acetoklastische (AcMe) und hydrogenotrophe Methanogenese (HyMe) bzw. einer Mischung aus beiden Methanogenesewegen (BoMe). Diese Trennung konnte auch durch Hauptkomponentenanalysen auf verschiedenen taxonomischen und funktionellen Ebenen bestätigt werden. Für einige Prozesse, wie der Glykolyse, wurde eine hohe funktionelle Redundanz beobachtet, wobei keine einzelnen Mikroorganismen dominant waren. Bei Prozessen die als limitierender Schritt bzw. Flaschenhals in der AD beschrieben wurden, wie die Hydrolyse und/oder die syntrophe Acetatoxidation, war hingegen eine geringe funktionelle Redundanz, bei gleichzeitiger Dominanz weniger Mikroorganismen vorhanden. In hydrogenotrophen Anlagen wurde Acetat überwiegend durch die syntroph Actetat-oxidierenden Bakterien Thermacetogenium phaeum und Syntrophaceticus schinkii zu H2 und CO2 oxidiert und von Methanoculleus bourgensis und Methanoculleus marisnigri zu Methan umgesetzt. In den acetoklastischen Anlagen wurde Acetat durch Mitglieder der Familie Erysipelotrichaceae gebildet und von Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei und Methanothrix soehngenii zu Methan umgesetzt. In Anlagen von BoMe wurde eine Koexistenz der genannten Organismen beobachtet und Methan über beide Methanogenesewege gebildet. Durch Korrelationsanalysen konnte das 60kDa Chaperonin groEL als geeigneter Biomarker für den Temperaturstress und die Abundanz der Methyl-Coenzyme-M-Reduktase als Marker für eine bevorstehende Übersäuerung identifiziert werden. Aufgrund der hohen Komplexität der Proteindaten wurden die mikrobiellen Netzwerke mit dem Algorithmus CoNet auf Basis der auf Speziesebene zusammengefassten, relativen Proteinabundanzen berechnet. Die Netzwerke zeigten deutliche Unterschiede hinsichtlich Komplexität und der Art der mikrobiellen Interaktionsmuster, wobei das Netzwerk für HyMe komplexer als AcMe und BoMe war. In HyMe und BoMe wurden außerdem deutlich mehr Interaktionen beobachtet, die auf Co-Präsenz der OTUs beruhten, als in AcMe. Anhand ihrer topologischen Indizes konnten D. tunisiensis und Peptococcaceae bacterium 1109 als Schlüsselorganismen identifiziert werden, die beide überwiegend an der Hydrolyse von Kohlenhydraten beteiligt waren. Eine weitere Sonderrolle nahmen 15 Pseudomonas spp. ein, deren Interaktionsmuster und Proteinexpression größtenteils über alle Netzwerke konserviert waren. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind auch von praktischer Bedeutung. Die Identifikation der genannten Biomarker ermöglicht es zukünftig Prozessstörungen frühzeitig zu erkennen und zu beheben, wodurch wirtschaftliche Schäden vermieden werden können. Das Vorhandensein von Kernmikrobiomen in BPs und STPs spricht dafür, dass sich die angestrebte Substratflexibilisierung in beiden Anlagentypen problemlos realisieren lässt. Bei dieser Substratflexibilisierung sollte darauf geachtet werden, eine hohe Diversität der mikrobiellen Gemeinschaft zu erreichen, um dieser eine gezielte Adaption an die geänderten Prozessbedingungen zu ermöglichen und Flaschenhälse im Abbauprozess zu vermeiden. Eine Möglichkeit stellt die Beimischung von Klärschlamm zum Substrat dar.

Abstract in weiterer Sprache

Biogas, which is generated during microbial degradation of organic waste under anoxic conditions, has the potential to contribute greatly to the intended energy transition. Future feeding of biogas (BPs) and sewage treatment plants (STPs) should get more flexible to meet feedstock and process conditions for a more economic operation. Therefore, a detailed understanding of the participating microorganisms as well as their microbial interaction patterns are essential. Therefore, the microbial communities of 16 BPs and 10 STPs were characterized using 16S rRNA gene amplicon sequencing. In addition, a metaproteomic approach enabled further taxonomic and functional characterization of BPs. Microbial communities in STPs were characterized by a significantly higher diversity and evenness compared to BPs. The bacterial core microbiome of BPs, defined as operational taxonomic units (OTUs) present in all plants, was composed of about 20 % of all bacterial OTUs and was responsible for a mean relative abundance of 94 %. It was mainly dominated by members of the family Thermotogaceae and the uncultured orders MBA08 and SHA-98. In STPs, about 33 % of the OTUs were part of the bacterial core microbiome, which accounted for roughly 70 % of the mean relative abundance. These dominating microorganisms were mainly assigned to the families Cloacamonaceae, Anaerolinaceae and the order Burkholderiales. Archaeal core microbiomes in BPs and STPs consisted of 16 and 10 OTUs, respectively. While members of Methanomicrobiaceae dominated in BPs, high abundances for members of Methanobacteriaceae and the uncultured family WSA2 were present in STPs. Correspondence analyses confirmed the observation of higher bacterial and archaeal diversity and variance in STPs. Canonical correspondence analysis indicated that bacterial communities in BPs were significantly affected by pH and temperature, while no significant effect for any process parameter was observed for STPs. In contrast, archaeal community compositions were significantly linked to proportions of cattle manure and corn in BPs and to pH in STPs. Based on relative abundances, microbial networks were calculated separately for BPs and STPs by using MENA algorithm, whereby STP network had a more complex network structure. The vast majority of microbial interactions was plant-specific. Based on their topology, a high proportion of nodes (20 %) were characterized as generalists in BP network, whereof many nodes were taxonomically assigned to Archaea. In contrast, only 4 % of nodes were assigned to generalists in STP network. Proteins for most of the important pathways of anaerobic degradation (AD) were identified by a metaproteomic approach using nanoLC-MS/MS. Proteins for methanogenesis, glycolysis and substrate uptake were dominating the absolute and relative abundances. Most of these proteins derived from the phyla Euryarchaeota, Firmicutes, Proteobacteria and Bacteroidetes. Functional assignment of proteins to different methanogenic pathways enabled classification of BPs into acetoclastic (AcMe) and hydrogenotrophic methanogenesis (HyMe), as well as a mixture of both pathways (BoMe). This classification was also observed by principal component analysis on different functional and taxonomical levels. Some processes, such as glycolysis were characterized by high functional redundancy without dominance of single microorganisms. Other well-known bottleneck processes of AD, such as hydrolysis and/or syntrophic acetate oxidation, showed a low functional redundancy in combination with few dominant microorganisms. During HyMe, acetate oxidized to H2 and CO2 by syntrophic acetate-oxidizing Thermacetogenium phaeum and Syntrophaceticus schinkii, was converted to methane by Methanoculleus bourgensis and Methanoculleus marisnigri. Acetate formed by Erysipelotrichaceae was converted to methane by Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei and Methanothrix soehngenii in plants with AcMe. In plants assigned to BoMe, all mentioned microorganisms participated in methanogenesis. Correlation analyses identified 60kDa chaperonin groEL as a biomarker for temperature stress, while measuring abundance of methyl-coenzyme M reductase seems to be promising for detecting upcoming acidification. Microbial networks were calculated based on relative protein abundances, which were summarized to species level. Due to the high data complexity algorithm, CoNet was chosen for this purpose. Network analyses displayed clear differences in complexity, as well as microbial interactions patterns for the different methanogenesis pathways, whereby microbial network of HyMe was more complex than AcMe and BoMe. In addition, more positive interactions were observed in HyMe and BoMe compared to AcMe. Calculation of topological indices identified Defluviitoga tunisiensis and Peptococcaceae bacterium 1109 as key players of AD, which were mainly active during hydrolysis of carbohydrates. Although the vast majority of interactions were specific for corresponding methanogenesis pathway, interactions patterns, as well as protein expression for 15 Pseudomonas spp. were highly conserved among all networks. The results of this work are also of practical significance. Identified biomarkers can enable an early detection and prevention of process disturbances in the future and therefore avoid economic losses. The presence of stable core microbiomes suggest that intended flexibilisation of substrate input is feasible for both plant types. Care should be taken to ensure a high diversity of the microbial community, which is necessary for a targeted adaption of the microbial community and could also avoid the emergence of bottlenecks. This can be accomplished by addition of sewage sludge to the substrate.