Entwicklung von Polymerfaser-Systemen in künstliche, biomimetische, polylactid basierte, ultra-hoch poröse Schwämme für Anwendungen in der Leber-Gewebezucht

Titelangaben

Mader, Michael:
Entwicklung von Polymerfaser-Systemen in künstliche, biomimetische, polylactid basierte, ultra-hoch poröse Schwämme für Anwendungen in der Leber-Gewebezucht.
Bayreuth , 2021 . - 164 S.
( Dissertation, 2021 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, bekannte Konzepte der bisher nur auf anorganischen Materialien oder nicht-abbaubaren Polymeren basierenden PFS, auch mit abbaubaren Polymeren zu realisieren und für Anwendungen in der biomimetischen Gewebezucht nutzbar zu machen. Der Fokus wurde auf die Entwicklung von Verfahren zur Herstellung monolithischer PFS aus Polylactid (PLA) sowie Mischsystemen aus PLA und Polycaprolacton (PCL) gelegt. Die resultierenden PFSEigenschaften, die einzelnen Herstellungsschritte und die dafür entscheidenden Einflussfaktoren wurden systematisch variiert und analysiert. Hierzu wurden mehrere qualitative als auch quantitative Analysen herangezogen. Der Einfluss der Polymer-eigenschaften sowie ihre chemisch-thermische Modifizierbarkeit wurde bestimmt, um den Zusammenhang zwischen Material- und PFS-Eigenschaften identifizieren und die Grenzen der Leistungsfähigkeit der Systeme evaluieren zu können. Hierzu wurde die PFS-Integrität, Belastbarkeit und Elastizität u.a. in Abhängigkeit zur thermischen Vernetzung, eingesetzten Faserdichte und unter Einfluss unterschiedlicher Umgebungsbedingungen quantifiziert. Um die Biokompatibilität und allgemeine Zellkultur Eignung der PFS zu evaluieren wurden statische Zellbesiedlungsexperimente durchgeführt. Zell-Verteilung, Zell-Viabilität und Zellpenetration ins Innere des PFS wurde ex-situ verfolgt und quantifiziert. Hierzu wurden digitale Licht- (LM), konfokale Laser Raster- (CLSM) sowie Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Aufnahmen angefertigt und ausgewertet. Die verwendeten, nicht-adhärenten Zellen konnten zwar nahezu ungehindert in den PFS eindringen, sich jedoch im Rahmen der Einschränkungen einer statischen Kultur nur oberflächlich vermehren. Dieser Umstand sollte unter Einsatz einer dynamischen Kultur und durch Einführen einer chemischen PFS-Biomodifizierung ausgeglichen werden. Zwei verschiedene Techniken zur Biomodifizierung von PLASchwämmen mit Galaktose (Gal) wurden verfolgt, um daraus elektrogesponnene Fasermatten und biomimetische PFS für die Leber- Gewebezucht herzustellen. Dies geschah durch Kombination von PLA mit Gal in Form eines PLA-Galaktose Copolymers (Gal-Träger). Die zunächst zu validierende Hypothese war, ob die Gal-Funktionalität des Gal-Trägers die literatur-bekannte Affinität zu Leberzellen vorweist und ob sich diese für die Zellbesiedlung der PFS förderlich zeigt. Für die Validierung wurden PLA-Gal Fasermatten durch Mischen beider Komponenten (PLA/Gal-Träger) über Elektrospinnen (ES) hergestellt und anschließend unter statischer Kultur mit unterschiedlichen Leber-Zelltypen gegenüber Referenzsystemen validiert. Zur Validierung wurde der Einfluss der Gal in-situ und ex-situ, in Gegenüberstellung parallel zellkulturierter Proben aus sowohl PLA-Gal wie auch PLA basierten Referenzsystemen variabler Hydrophilie quantifiziert. Die in-situ und ex-situ Ergebnisse der Zellkultur mit PLA-Gal Fasermatten geben eine signifikant erhöhte Zellaffinität und Proliferationssteigerung gegenüber den Referenzsystemen preis. Die Rezeptor- Interaktion von Hepatozyten und Gal wurde in-situ durch Regulierung mit Blocker-Ionen verfolgt und verifiziert. Nach Validierung wurden die PLA-Gal Fasermatten zu PFS weiterverarbeitet, um ihre Eignung als Basis für die Entwicklung einer 3D Leber-biomimetischen Zelltest- Plattform auch unter dynamischer Zellkultur zu prüfen. Ein Perfusions- Bioreaktor wurde entwickelt, welcher einen PFS vollständig umschließt und seine stetige Perfusion ermöglicht. Im Gegensatz zu PLAPFS, zeigen die Bioreaktor-Kultur Ergebnisse mit PLA-Gal PFS eine maßgeblich verbesserte, gleichmäßige Zellverteilung innerhalb des PFS. Um zukünftig die für eine Galaktosylierung von PLA Fasersystemen, wie das Misch-Elektrospinn Verfahren, benötigte Menge an Gal- Träger Material reduzieren zu können, wurde eine Methode zur Beschichtung von PLA-Schwämmen entwickelt. Auf Grund einer unerwartet ausgeprägten Photolumineszenz des Gal-Trägers stellten sich CLSM Messungen für den Nachweis der Beschichtung und der Analyse seiner Qualität als hoch vielversprechend heraus. Die spektroskopisch charakterisierte, ausgeprägte Autofluoreszenz des Gal-Trägers ermöglicht eine hochauflösende, 3D Visualisierung galaktosylierter PLA-Gal Fasern und somit des Schwamm Faser-Netzwerks unter UV-CLSM. Die Ergebnisse belegen, dass monolithische PLA-PFS erfolgreich und gleichmäßig mit dem Gal-Träger beschichtet und so nachhaltiger biomodifiziert werden können. Monolithische PLA-PFS wurden für Untersuchungen mit pharmazeutischer Anwendungsrelevanz modifiziert, um sie zur Klärung grundlegender physikalischer und pharmazeutischer Frage-stellungen einsetzen zu können. Die Weiterentwicklung der PFS beinhaltet deren Beschichtung und anschließende Beladung mit physiologisch relevanten Flüssigkeiten, wie eines in der Pharmazie gebräuchlichen Öls, als mögliche flüssig-Medikamententräger. Die äußere und innere PLA-PFS Oberfläche wurde mit Poly-(para-xylylen) beschichtet und charakterisiert in Bezug auf die PFS Beschichtungsqualität, den Oberflächeneigenschaften sowie der Medium-Beladungskapazität. Es wurden genaue Analysen der mechanischen Belastbarkeit und Elastizität der PFS in trockenem Zustand sowie nach Beladung mit Öl durchgeführt. Hierbei wurden die PFS im Hinblick auf Ihre Fähigkeiten zur Öl-Rückhaltung und Wiederaufnahme nach Freisetzung unter Kompression, auch bei unterschiedlicher prozentualer Öl-Beladung, untersucht. Unterschiedliche in-vivo Transplantationssituationen wurden simuliert, um die Aufnahme von Flüssigkeiten in den PFS und die Rückhaltung im Schwamm-Gerüst zu untersuchen. Im Direktvergleich wurde das Freisetzungsprofil eines Modell-Medikaments im Ölbeladenen PFS gegenüber der aus freiem Öl analysiert. Mit Mikro- Computertomographie (μCT) und Elektronen-paramagnetische Resonanzspektroskopie (EPR) wurden 3D Aufnahmen der Medium- Penetration in den PFS angefertigt, analysiert und quantifiziert. Mit Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) wurde das Verhaltens des freien und im PFS-Gerüst gehaltenen Mediums und seiner Interaktion mit dem PFS analysiert. Unterschiede in der molekularen Relaxation und Diffusion der Flüssigkeit wurden bestimmt, um die Auswirkungen auf die Freisetzung von Medikamenten evaluieren zu können.

Abstract in weiterer Sprache

The aim of this work was to first adapt known concepts of PFS fabrication, as yet limited to inorganic or non-degradable polymer materials, to work with degradable polymers and create biomimicking PFS scaffolds that can be used for tissue engineering (TE) applications. The focus was set to elaborate a fabrication technique for monolithic PFS using polylactide (PLA) and blend-systems of PLA and polycaprolactone (PCL). The resulting PFS-properties, each individual fabrication step and the correlating, most relevant impact-factors were systematically varied and analyzed. Therefore, both qualitative and quantitative analysis techniques were performed. The influence of the polymer used, its properties and chemico-thermal modifiability was determined to identify the relationship between material- and PFS-properties and evaluate the limitations and performances of the PFS produced. The PFS integrity, resilience and elasticity was quantified under varying environment conditions and in dependence on the scaffold-density used and the thermal annealing based crosslinking process applied. In order to analyze the biocompatibility and general cell-culture applicability of PFS systems, static cell-seeding and cell-culture experiments were performed in a cooperation work. Cell-distribution, cell-viability, and cellpenetration into PFS was traced and quantified ex-situ. Therefore, digital light- (LM), confocal laser scanning- (CLSM) and electron scanning microscopy imaging (SEM) measurements were performed and evaluated. The applied (non-adherent) cells were able to infiltrate the sponge, but, due to the static culture and its cell nutrition limitations, cellproliferation was limited to the superficial scaffold regions. This constraint was aimed to be solved by using dynamic culturing and introducing biomodifications to the PFS. Two different PLA sponge galactose (Gal) biomodification techniques were investigated to create electrospun PLA-Gal nonwovens and biomimetic PFS for liver-cell cultivation, by combining PLA with Gal using a PLA-Gal copolymer (Gal-carrier). The hypothesis to be validated was, whether the Gal moiety of the galcarrier can come up with the literature-known liver-cell specific cellaffinity and whether it allows to improve cell-delivery into PFS. For the Gal-carrier validation, PLA-Gal nonwovens were produced by blending PLA and the PLA-carrier using electrospinning (ES) and applied in static culture experiments with different cell-types and nonwoven references. The validation was used the evaluate and quantify the impact of the Gal presence in-situ and ex-situ, using PLA-Gal and PLA-based reference systems of variable hydrophilicity as benchmark. The in-situ and ex-situ validation results of PLA-Gal nonwovens reveal a significant increase in hepatic cell-affinity and proliferation. The receptor interaction of hepatocytes and Gal was verified by regulating cell-interaction with receptor blocking ions, traced in-situ. After validation, the PLA-Gal nonwovens were processed into PFS to prove their applicability to use them as a 3D liver-biomimetic cell-testing platform basis. Therefore, a bioreactor was designed in development cooperation to fully enclose the PFS and grant its steady perfusion during culture. In contrast to PLA-PFS, the bioreactor-culture of PLA-Gal PFS reveals a significantly enhanced distribution of hepatocytes within the entire PFS. In order to reduce the amount of Gal-carrier necessary for galactosylation of PLAfiber systems, compared to blend-ES, a PLA-PFS coating technique was developed. Due to an unexpected, strongly pronounced photoluminescence of the Gal-carrier, CLSM measurements have proven to be highly applicable to verify the presence of a PLA-Gal coating and precisely evaluate its distribution quality. The pronounced autofluorescence of the Gal-carrier was analyzed spectroscopically and allows for highresolution UV-CLSM imaging to 3D visualize galactosylated PLA-Gal nonwoven fibers and the PFS fiber network. The results prove, that the PLA-PFS coating can be successfully and homogeneously applied, helping to create more sustainably biomodified scaffolds. Monolithic PLAPFS were modified for pharmaceutic application relevant investigations aiming to clarify basic physical and pharmaceutical scientific questionings. The elaboration of the PFS includes their coating and subsequent loading with physiologically relevant media, such as a pharmaceutically commonly used oil, as possible drug-carrier fluids. The outer- and internal surface of PLA-PFS was coated with poly(paraxylylene) and characterized in detail, in regard to the achieved coating quality, the surface properties and the sponge fluid-loading capacity. Detailed analysis of the PFS mechanical resilience and elasticity after compression in dry and oil-loaded state was performed. The PFS capability to retain and reabsorb oil after compression release was investigated, also including different grades of initial oil-loading. Different invivo transplantation situations were simulated to allow investigating the fluid-absorption and retaining process of PFS. The release profile of a model-drug in an oil-loaded PFS compared to free fluid was investigated as well. The 3D fluid-penetration into the PFS was analyzed by micro-computer tomography (μCT) and electron-paramagnetic resonance spectroscopy (EPR). The behavior of free and PFS-bound fluid and its interaction with the PFS was analyzed by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR). Differences in molecular relaxation and diffusion of the fluid inside PFS were evaluate and used to conclude their impact on a model drug-release from PFS.