Effect of micro biocides on Listeria monocytogenes

Titelangaben

Szendy, Maik:
Effect of micro biocides on Listeria monocytogenes.
Bayreuth , 2021 . - XXIV, 179 S.
( Dissertation, 2020 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Listeria monocytogenes ist ein bedeutendes, durch Lebensmittel übertragenes pathogenes Bakterium, welches Listeriosen verursachen kann und daher weltweit zu gesundheitlichen Problemen und wirtschaftlichen Verlusten führt. Der Verzehr von Lebensmitteln, die kontaminiert mit L. monocytogenes sind, führt zur Übertragung der Krankheit auf den Menschen, zum Beispiel durch Milchprodukte. Lebensmittelsicherheitsmanagementsysteme geben Leitlinien zur Kontrolle von Krankheitserregern, die durch Lebensmittel übertragenen werden, vor. Dies kann durch ein strenges Reinigungs- und Desinfektionsregiment erreicht werden. Mikrobiozide werden daher in Molkereiproduktionsanlagen eingesetzt, um das Wachstum von L. monocytogenes zu inhibieren. Das Ziel der ersten Studie war es, die Wirksamkeit von Mikrobioziden zu bewerten und die Empfindlichkeit von L. monocytogenes Feldisolate gegenüber Mikrobioziden zu bestimmen. In der zweiten Studie wurde ebenfalls die Zellantwort der L. monocytogenes Feldisolate auf das antimikrobiell wirkende Konservierungsmittel Nisin untersucht. Häufig wird Weichkäse mit freiem Nisin versetzt, um L. monocytogenes wirksam zu hemmen. Diese erhobenen Daten lieferten die Grundlage für die letzte Studie, um die Nisinformulierungen in vitro und in Sauermilchkäse (SMK) zu erproben. Zwei Panel mit jeweils 251 und 282 L. monocytogenes Feldisolaten aus deutschen Rohprodukten, verzehrfertigen Lebensmitteln, Patientenproben und aus lebensmittelverarbeitenden Umgebungen sowie Listeria spp. Referenzstämme wurden in der ersten Studie analysiert. In der ersten und letzten Studie wurde die Mikrodilution in Bouillon als Test für die Wirksamkeits- und Toleranzstests verwendet. Daher wurden vier Desinfektionsmittel (H2O2, NaOCl, Benzalkoniumchlorid und Cetalkoniumchlorid), zwei seit langem verwendete antimikrobielle Konservierungsmittel (freies Nisin und NaNO2) und ein Aromastoff (Citral), welcher ein potentiell neues antimikrobielles Konservierungsmittel darstellt, gegen L. monocytogenes Feldisolate getestet. Vorab wurde ein experimentelles Design entwickelt, welches eine hohe Vergleichbarkeit in Bouillon, die organische Rückstände simulierte, zwischen allen Mikrobioziden ermöglichte. Die Wirksamkeit der Mikrobioziden war in Gegenwart von organischen Verbindungen außer beim Desinfektionsmittel NaOCl unverändert. Darüber hinaus korrelierten hohe minimale Hemmkonzentrationen (MHKs) von NaOCl und Citral mit MHKs von zwei therapeutisch relevanten Antibiotika, während für freies Nisin keine Korrelation gefunden wurde. Die Mehrheit der nisintoleranten L. monocytogenes Feldisolate (NNS) war vom Serotyp IIa und wurde in Milchprodukten gefunden. Diese Beobachtung führte zu der Frage, warum NNS-Feldisolate des Serotyps IIa in dieser Umgebung häufig vertreten waren, während ihr Vorkommen in anderen Lebensmittelumgebungen geringer war. Um diese Frage in der zweiten Studie zu beantworten, wurden vier Nisin empfindliche (NS) und zwei NNS L. monocytogenes Feldisolate des Serotyps IIa einer vollständigen Genomsequenzierung unterzogen. Die nachfolgende Analyse von Genen, die mutmaßlich mit Nisintoleranz und deren Regulation assoziiert sind, fand DNA Sequenzvarianten (DSVs) im gadD2-Gen, welches für die Glutamatdecarboxylase kodiert. Dort unterschieden sich die NNS von NS Feldisolate von einander. Die gleichen spezifischen DSVs in gadD2 wurden ebenfalls in sieben weiteren NNS Feldisolaten gefunden. In Gegenwart von freiem Nisin und bei einem pH-Wert von 7,0 hatten NNS Feldisolate im Vergleich zu NS Feldisolate eine wesentlich kürzere Verzögerungsphase in der Wachstumskurve. Modellierung des GadD2 zeigte, dass durch ein Aminosäureaustausch an Position 453, Asparaginsäure zu Asparagin, das aktive Zentrum bei pH 7,0 nicht blockiert wurde. Dies führte vermutlich zu einer weniger pH-abhängigen enzymatischen Aktivität. Der SMK wurde als wichtige Matrix identifiziert, die die antimikrobielle Aktivität von freiem Nisin reduzierte. Daher wurde im Rahmen der letzten Studie eine neue Nisinformulierung, Neusilin UFL2-N (UFL2-N), entwickelt. Diese ermöglichte die Freisetzung von adsorbierten Nisin aus Neusilin UFL2 in einer Umgebung, die dem pH des Sauerquarks ähnelte. In BHI-Bouillon und über einen weiten pH-Bereich war UFL2-N in der Lage, mit freiem Nisin zu konkurrieren. Die resultierenden MICs beider Nisinformulierungen waren vergleichbar. Wenn die Nisinformulierungen auf kontaminierten SMK Oberflächen aufgetragen wurden, zeigten bei der höchsten getesteten Konzentration sowohl UFL2-N als auch freies Nisin antilisteriale Aktivität und L. monocytogenes blieb unterhalb der Quantifizierungsgrenze der qPCR. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass die Wirksamkeit der Mikrobiozide gegen L. monocytogenes durch organische Rückstände beeinträchtigt wurde, während die MHKs von Nisin nicht erhöht waren. Weiterhin bestätigten die Resultate die laufende Diskussion, ob DSVs in gadD2 die Nisintoleranz unterstützen. UFL2-N ermöglichte eine langsame Freisetzung und antilisteriale Aktivität in vitro sowie auf der SMK Oberfläche.

Abstract in weiterer Sprache

Listeria monocytogenes is a major foodborne pathogenic bacterium causing listerioses, which leads to human health problems and economic losses globally. Transmission of the disease to humans is usually due to consumption of L. monocytogenes contaminated food, e.g. dairy produce. Food safety management systems provide guidance to control the foodborne pathogens by a strict cleaning and sanitizing regime. Hence, micro biocides are applied in dairy production plants to prevent outgrowth of L. monocytogenes. The goal of the first study of this thesis was to evaluate the efficacy of micro biocides and to determine the tolerance of micro biocides to L. monocytogenes field isolates. In the second study, it tackles about the response of L. monocytogenes field isolates of the antimicrobial preservative free nisin since it is frequently added to soft cheese to effectively inhibit L. monocytogenes. These data provided the prerequisites of the last study for employing nisin formulations in vitro and in sour curd cheese (SCC). Two comprehensive panels with 251 and 282 L. monocytogenes field isolates from German raw food products, ready-to eat foods, patient samples and food-processing environments as well as Listeria spp. reference strains were analyzed in the first study. For the first and last study, broth microdilution was applied as assay for efficacy and susceptibility testing. Hence, four disinfectant compounds (H2O2, NaOCl, benzalkonium chloride and cetalkonium chloride), two long-established antimicrobial preservatives (free nisin and NaNO2) as well as one flavoring substance (citral), a potential new antimicrobial preservative, were tested against L. monocytogenes field isolates. An experimental design was established enabling a high comparability between all micro biocides, which were dissolved in culture broth mimicking organic debris. The efficacy of micro biocides was exceptionally unaltered in the presence of organic compounds except for disinfection compound NaOCl. Moreover, high minimal inhibitory concentrations (MICs) of NaOCl and citral were correlated to MICs of two important therapeutic antibiotics while no correlation was found for free nisin. The majority of nisin non-susceptible L. monocytogenes field isolates (NNS) were serotype IIa and were found in dairy produce. This observation raised the question why NNS field isolates of serotype IIa were frequent in this environment whereas occurrence in other origin of isolation was lower. To address this question in the second study, four nisin susceptible (NS) and two NNS L. monocytogenes field isolates of serotype IIa were subjected to whole genome sequencing. Subsequent analysis of genes putatively associated with nisin tolerance and its regulation resulted to DNA sequence variants (DSVs) in the gadD2 gene encoding for the glutamate decarboxylase that differed NNS from NS field isolates. The same specific DSVs in gadD2 were found in seven more NNS field isolates. Likewise, NNS field isolates had a substantial shorter lag phase compared to NS in presence of free nisin at pH 7.0. The GadD2 model showed that due to an amino acid substitution at position 453, aspartic acid to asparagine, the active site was not blocked at pH 7.0. Presumably, this resulted to a less pH-depended enzyme activity. The SCC matrix was identified as an important factor reducing the antimicrobial activity of free nisin. Hence, a new nisin formulation called Neusilin UFL2-N (UFL2-N) was developed within the last study of this thesis tailoring the release of nisin from Neusilin UFL2 under a sour curd likely environment. In BHI broth, UFL2-N was competitive to free nisin over a wide pH range with similar MICs. When both nisin formulation were applied on contaminated SCC surface, UFL2-N and free nisin showed antilisterial activity and kept L. monocytogenes below quantification limit of qPCR at the highest applied concentration. Collectively, the data indicated that the efficacy of micro biocides against L. monocytogenes was affected by organic debris while MICs of nisin were not increased. Results confirmed the ongoing discussion that DSVs in gadD2 supports NNS state. Lastly, UFL2-N enabled a slow release and antilisterial activity in vitro as well as on SCC surface.