Selektion Internalin-bindender Peptide : Neue Wege zur Verhinderung der Infektiosität und des Wachstums von Listeria monocytogenes

Titelangaben

Kenzel, Julia:
Selektion Internalin-bindender Peptide : Neue Wege zur Verhinderung der Infektiosität und des Wachstums von Listeria monocytogenes.
Bayreuth , 2020 . - VII, 124 S.
( Dissertation, 2020 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die Nachfrage der Konsumenten nach frischen und natürlich behandelten Lebensmitteln sowie die hohen Anforderungen in der Lebensmittelsicherheit fordern neue und innovative Strategien zur Detektion und Eliminierung von Lebensmittelpathogenen. Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) zählt zu den häufigsten und gefährlichsten durch Lebensmittel übertragenen Pathogenen und ist der Verursacher von Listeriose, die trotz Antibiotika-behandlung eine Mortalitätsrate von bis zu 30 % aufweist. Derzeit verfügbare Methoden zur Listeria-Detektion sind kostspielig und zeitintensiv. Ziel dieser Arbeit war es, innovative Ansätze zu entwickeln, die zur Detektion des Bakteriums und zur Prävention der Listeria-Infektion beitragen sollen. Frühere Studien mit Antikörpern gegen L. monocytogenes lieferten eine unzureichende Selektivität und Spezifität. Die Verwendung spezifischer Peptide bietet hierbei eine Alternative und eignet sich besonders durch die hohe Stabilität und die kostengünstige standardisierte Produktion der Peptide. Hierfür wurde die Selektion L. monocytogenes-bindender Peptide erstmals mit einem Protein-basierten Phagen-Display durchgeführt. Bisher publizierte Peptide wurden unter Verwendung ganzer Zellen selektioniert, wodurch das Target der resultierenden Peptide unbekannt ist. In dieser Arbeit wurden Peptide aus 12 Aminosäuren identifiziert, die an L. monocytogenes-spezifische Oberflächenproteine Internalin A und Internalin B binden. Internalin A und Internalin B induzieren durch ihre Interaktion mit humanen Rezeptoren, E-Cadherin bzw. c-Met, die Invasion des Bakteriums in humane Wirtszellen und sind für den Infektionszyklus essenziell. Für die Selektion wurden zunächst rekombinante Proteine Internalin A(36-496) und Internalin B(36-321) gereinigt und ihre Bindung an den jeweiligen humanen Rezeptor verifiziert. Anschließend konnten in dieser Arbeit Internalin A-bindende Peptide mit den Aminosäuresequenzen GLHTSATNLYLH (JB1) und DSQFNKYSIATV (JB2) selektioniert werden. Ihre Bindung an sowohl rekombinantes Internalin A als auch an ganze Zellen L. monocytogenes wurde erfolgreich untersucht. Zudem konnte gezeigt werden, dass durch die Bindung von JB1 und JB2 an Internalin A die Interaktion zwischen Internalin A und E-Cadherin verhindert wird, wodurch die Internalisierung in epitheliale Wirtszellen verhindern werden könnte. Außerdem konnte erstmals gezeigt werden, dass Internalin A und Internalin B neben E-Cadherin bzw. c-Met mit dem humanen hepatischen Rezeptor IGF2R (insuline like growth factor 2 receptor) interagieren. Die Bindung des Bakteriums mit IGF2R ermöglicht die Invasion in Hepatozyten, der listeriale Interaktionspartner war bislang jedoch nicht bekannt. In einem weiteren Phagen-Display wurden die Peptide YSLRLTSVTAPT (JB6) und LTPHKHHKHLHA (JB8) gegen Internalin B selektioniert. Die Interaktion beider Peptide mit rekombinantem Internalin B und L. monocytogenes konnte erfolgreich gezeigt werden. JB8 wurde anschließend für die synthetische Kopplung an eine antimikrobiell wirkende Hopfenkomponente verwendet. Hopfenkomponenten aus der weiblichen Hopfenpflanze Humulus lupulus sind für ihre antimikrobielle Aktivität gegen grampositive Bakterien bekannt. Sie wirken als Ionophore und schädigen die bakterielle Zellmembran oder den Transmembran-Protonengradienten. Hopfenextrakte werden bereits in der Konservierung von Lebensmitteln eingesetzt, um das Wachstum von L. monocytogenes zu verhindern. Konzentrationsbedingte negative Geschmacksveränderungen sollen durch eine Verringerung der Dosierung vermieden werden. Durch die Verknüpfung der Hopfenkomponente mit einem Internalin B-bindenden Peptid sollte die Substanz gezielt an die Bakterienmembran lokalisiert und damit die anti-listeriale Wirkung verstärkt werden. Die Auswahl einer für die Verknüpfung geeigneten Hopfenkomponente sowie die Bestimmung optimaler Versuchsbedingungen erfolgten durch Messungen der minimalen Hemmkonzentration (MHK) dreier Substanzen: Hulupinsäure, Xanthohumol und Lupulon. Dabei wurde für Xanthohumol eine MHK von 2,5 µg/ml bei pH 6,0 und 30 °C ermittelt und diese Hopfenkomponente mit Peptid JB8 verknüpft. Xanthohumol und Lupulon erwiesen sich als weniger geeignet. Eine antimikrobielle Aktivität des Konjugats Xanthohumol-JB8 konnte zwar gezeigt werden, die postulierte Verringerung der MHK im Vergleich zu Xanthohumol konnte allerdings zunächst nicht erzielt werden. Allerdings sind hierbei viele Parameter, wie die Art der Verknüpfung, entscheidend und können weiterführend optimiert werden. Die erstmals gegen Oberflächenproteine von L. monocytogenes selektionierten Internalin A- und Internalin B-bindenden Peptide JB1, JB2, JB6 und JB8 liefern jedoch einen entscheidenden Beitrag für die Entwicklung neuer Detektionsmethoden von L. monocytogenes sowie zur Verhinderung des pathogenen Mechanismus. Markierungen der spezifischen Peptide mit beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffen könnten eine schnelle Detektion des Bakteriums in humanen Zellen oder Lebensmittelproben ermöglichen. Zusätzlich könnten diese spezifischen Peptide zur Inhibition der Interaktion zwischen den Internalinen und den humanen Rezeptoren verwendet werden, um den Eintritt des Pathogens in Wirtszellen zu verhindern.

Abstract in weiterer Sprache

The increase in consumer demand for fresh and naturally processed foods, together with high-quality standards for food safety improvement, has fueled research for new and innovative strategies for detection and elimination of food pathogens. Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) is one of the most prevalent and deadliest foodborne pathogens. It causes listeriosis, which shows a mortality rate up to 30 % of the reported human infections, in spite of antibiotic treatment. The currently available methods for listeria-detection are mostly culture techniques which are cost and time intensive. To enhance the detection and identification of the pathogen and to meet current demands for food safety testing, more rapid methods are required. The aim of this thesis was to develop innovative concepts for the detection and inhibition of the listeria-infection. Previous studies with antibodies against L. monocytogenes provided no sufficient selectivity and sensitivity. The use of specific peptides is an attractive alternative and offers high stability and low-cost standardized production. Therefore, for the first time, L. monocytogenes-binding peptides were selected via a protein-based phage display. Previously published peptides were selected using whole cells as targets in the phage display approach resulting in peptides with unknown targets on the bacterial surface. Here, 12 aminoacid-peptides, interacting with the L. monocytogenes-specific surface proteins internalin A and internalin B, were identified. Internalin A and internalin B bind at human receptors E-cadherin and c-Met, respectively. The interaction induces the internalization of the pathogen into human host cells and is essential for its infection cycle. For the selection, recombinant proteins internalin A(36-496) and internalin B(36-321) were purified and investigated for their binding to the respective human receptors. Afterwards, two internalin A-binding peptides – GLHTSATNLYLH (JB1) and DSQFNKYSIATV (JB2) – were developed. Their interaction to recombinant internalin A and to L. monocytogenes cells was shown successfully. In addition, by binding internalin A, JB1 and JB2 inhibited the interaction between internalin A and E-cadherin, resulting in a potential inhibition of invasion into epithelial host cells. For the first time, it could be shown that internalin A and internalin B interact with the human hepatic receptor IGF2R (insuline like growth factor 2 receptor). The interaction between IGF2R and the pathogen enables the invasion into hepatocytes. The listerial interaction partner was yet unknown. In this study, peptides YSLRLTSVTAPT (JB6) and LTPHKHHKHLHA (JB8) were selected via a second phage-display against internalin B. The binding of both peptides to recombinant internalin B and L. monocytogenes was demonstrated. JB8 was used for the synthesis of a conjugate with an antimicrobial hop compound. Hop compounds, deriving from the female hop plant Humulus lupulus, are known for their antimicrobial activity against Gram-positive bacteria. By acting as ionophores, they destroy the microbial cell membrane or the transmembrane gradient. Hop extracts are already used for food preservation and inhibition of growth of L. monocytogenes but can result in bitter taste from high agent concentrations that are needed for bacterial death. Thus, lower concentrations of hop extracts are needed to reduce the negative effect on the product. By conjugation of the hop component with an internalin B-binding peptide, the substance should be located directly at the bacterial membrane and enhance the anti-listerial activity. The antimicrobial activity of three hop compounds (hulupinic acid, xanthohumol, lupulon) was investigated to select the ideal components for the peptide and hop compound hybrid. For the conjugation with JB8, xanthohumol was selected with a minimum inhibitory concentration (MIC) of 2.5 µg/ml (pH 6.0, 30 °C). Xanthohumol and lupulon was proven to be less suitable. The antimicrobial activity of the hybrid xanthohumol-JB8 was shown successfully, but a reduction of MIC in comparison to xanthohumol could not be realized. However, lots of parameters, such as the type of conjugation, are crucial and have to be optimized. Nevertheless, for the first time peptides JB1, JB2, JB6 and JB8, binding internalin A and internalin B, respectively, were developed. The identification of these peptides is a significant contribution for the development of new L. monocytogenes-detection methods and for the inhibition of the pathogenic mechanism. Labeling of these peptides with a fluorophore could facilitate rapid detection of listeria in human cells or in food samples. Additionally, these specific peptides might be used to inhibit the interaction between internalin and human receptors and thus to avoid the entry of the pathogen into host cells.