The Caspase-like Cell Cycle Protease Separase : Upstream Regulations and Downstream Functions

Titelangaben

Hellmuth, Susanne:
The Caspase-like Cell Cycle Protease Separase : Upstream Regulations and Downstream Functions.
Bayreuth , 2020 . - 197 S.
( Dissertation, 2020 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Separase universally triggers eukaryotic anaphases by cleavage of sister chromatid cohesion mediating cohesin. Until then, this essential protease is kept inactive by association with securin. Separase can alternatively be inhibited by association with Cdk1-cyclin B1 but the corresponding complex is scarce in early mitosis and cannot explain why vertebrate securin is dispensable. Protein phosphatase 2A (PP2A) also binds separase but the physiological role of this interaction remains enigmatic. Silencing of the spindle assembly checkpoint (SAC) in metaphase enables the ubiquitin ligase APC/C to mediate the proteasomal destruction of securin (and cyclin B1), thereby activating separase. Despite being structurally related to caspases, separase has not been previously linked to apoptosis. Instead, two studies suggested a role of yeast separase in DNA damage repair but left unanswered whether this non-canonical interphase function of separase is conserved in mammals. Studying upstream regulations and downstream functions of vertebrate separase, I discovered the following: 1) Securin associates co-translationally with separase and prevents its aggregation. This suggests that it might assist the proper folding of this giant protease and offers a first mechanistic explanation for the genetic evidence that securin is not only an inhibitor but also an activator of separase. 2) APC/C prefers phosphorylated securin over un-phosphorylated securin as a substrate. While free securin is phosphorylated in mitosis, separase-bound securin is kept in an unphosphorylated state by associated PP2A. This effecuates supernumerous securin to be degraded first and largely gone by the time separase-associated securin is targeted for proteolysis. Thereby, premature activation of separase is prevented and the metaphase-to-anaphase transition sharpened. 3) Once liberated, separase is subject to conformational change by the peptidyl-prolyl isomerase Pin1 and thereby rendered resistant against residual securin. At the same time, this limits separase's proteolytic half-life and allows cohesin to be reloaded onto telophase chromatin without being cleaved. 4) Pin1 catalyzed trans-to-cis isomerization of separase is essential for Cdk1-cyclin B1-dependent inhibition and explains why the kinase and securin bind separase in a mutually exclusive manner. 5) Formation of the Cdk1-cyclin B1-separase complex is counter-acted by phosphorylation of cyclin B1 in early mitosis. Dephosphorylation results in a second peak of Cdk1-cyclin B1-separase complex formation in late mitosis when most cyclin B1 has already been degraded. 6) Upon destruction of this last cyclin B1 in early G1 phase, separase is released from the late Cdk1-cyclin B1-separase complex and triggers centriole disengagement, thereby licensing later centrosome duplication. 7) Human shugoshin 2 (Sgo2), a protector of meiotic cohesin with hitherto unknown function in somatic cells, represents a crucial second branch of anaphase regulation. It is enabled by SAC-activated Mad2 to bind and inhibit separase and can functionally replace securin. Acute depletion of Sgo2 and securin (but not the individual knock-downs) result in separase deregulation and premature loss of cohesion. 8) The AAA-ATPase Trip13 actively disassembles the separase-Sgo2-Mad2 complex upon SAC silencing in metaphase. Thus, while the canonical, securin-dependent branch of anaphase control requires proteolysis, the release of active separase from Sgo2-Mad2 does not. 9) Human separase facilitates the repair of DNA double strand breaks (DSBs) by homologous recombination. A number of post-translational modifications result in the recruitment of separase from the cytoplasm to DSBs. Here, separase is activated and locally cleaves cohesin, which might grant the repair machinery access to the damaged DNA. 10) Cleavage of Mcl1 and Bcl-xL by separase transforms these pro-survival factors into proapoptotic fragments and triggers death in mitosis via the intrinsic pathway of apoptosis. The C-terminal cleavage fragment of Mcl1 forms cytochrome c conducting pores into the mitochondrial outer membrane, an ability which was previously thought to be limited to Bak and Bax. 11) Mcl1 and Bcl-xL are substrates for separase only when phosphorylated by Nek2a. Simultaneous activity of both enzymes only occurs when cells rush through mitosis due to pathological loss of the SAC. Nek2a and separase therefore represent a 'minimal duration of early mitosis checkpoint' (DMC), which triggers apoptosis of cells that are doomed to chromosome missegregation.

Abstract in weiterer Sprache

Separase löst alle eukaryotischen Anaphasen aus, indem sie kohäsionsvermittelndes Cohesin spaltet. Bis dahin wird diese essentielle Protease durch Securin inhibiert. Separase kann alternativ durch Assoziation mit Cdk1-Cyclin B1 gehemmt werden, aber der entsprechende Komplex ist in der frühen Mitose wenig abundant und kann nicht erklären, warum Securin in Vertebraten entbehrlich ist. Die Proteinphosphatase 2A (PP2A) bindet Separase ebenfalls, aber die physiologische Rolle dieser Interaktion bleibt rätselhaft. Durch die Inaktivierung des 'spindle assembly checkpoint' (SAC) in der Metaphase kann die Ubiquitin-Ligase APC/C die proteasomale Zerstörung von Securin (und Cyclin B1) vermitteln und dadurch Separase aktivieren. Obwohl sie strukturell mit Caspasen verwandt ist, wurde Separase bisher nicht mit der Apoptose in Verbindung gebracht. Stattdessen wurde in zwei Studien eine Rolle der Hefe-Separase bei der Reparatur von DNS-Schäden vorgeschlagen. Die Frage, ob diese nichtkanonische Interphase-Funktion von Separase in Säugern konserviert ist, blieb jedoch unbeantwortet. Meine Untersuchung von Regulationsmechanismen und Funktionen der Wirbeltier-Separase ergab die folgenden Ergebnisse: 1) Securin assoziiert kotranslational mit Separase und verhindert ihre Aggregation. Dies legt nahe, dass es die korrekte Faltung dieser riesigen Protease unterstützen könnte, und bietet eine erste mechanistische Erklärung für den genetischen Nachweis, dass Securin nicht nur ein Inhibitor, sondern auch ein Aktivator von Separase ist. 2) APC/C bevorzugt als Substrat phosphoryliertes gegenüber unphosphoryliertem Securin. Während freies Securin in der Mitose phosphoryliert wird, wird das an Separase gebundene Securin durch assoziierte PP2A in einem unphosphorylierten Zustand gehalten. Dies bewirkt, dass überzähliges Securin zuerst abgebaut wird und weitgehend verschwunden ist, wenn die Proteolyse von Separase-assoziiertem Securin beginnt. Dadurch wird eine vorzeitige Aktivierung der Separase verhindert und der Metaphase-Anaphase-Übergang geschärft. 3) Einmal freigesetzt, unterliegt Separase einer Konformationsänderung durch die Peptidyl-Prolyl-Isomerase Pin1. Dies macht sie gegen restliches Securin resistent. Gleichzeitig wird dadurch die Aktivität von Separase zeitlich begrenzt, so dass Cohesin bereits in Telophase erneut auf Chromatin geladen werden kann ohne gespalten zu werden. 4) Die Pin1-katalysierte Separase-Isomerisierung von trans nach cis ist für die Cdk1-Cyclin B1-abhängige Inhibition essentiell und erklärt, warum die Kinase und Securin nicht gleichzeitig mit Separase assoziieren können. 5) Die Bildung des Cdk1-Cyclin B1-Separase-Komplexes wird durch Phosphorylierung von Cyclin B1 in der frühen Mitose gehemmt. Die Dephosphorylierung führt zu einem zweiten Maximum von Cdk1-Cyclin-B1-Separase in der späten Mitose, obwohl zu diesem Zeitpunkt das meiste Cyclin B1 bereits abgebaut ist. 6) Bei der Zerstörung dieses letzten Cyclin B1 in der frühen G1-Phase wird Separase aus dem späten Cdk1-Cyclin B1-Separase-Komplex freigesetzt und löst dann die Entkopplung der Zentriolen aus, wodurch eine spätere Zentrosomen-Duplikation lizensiert wird. 7) Humanes Shugoshin 2 (Sgo2), ein Protektor von meiotischem Cohesin mit bisher unbekannter Funktion in somatischen Zellen, stellt einen entscheidenden zweiten Zweig der Anaphasenregulation dar. Es wird durch SAC-aktiviertes Mad2 in die Lage versetzt, Separase inhibitorisch zu binden und kann Securin funktionell ersetzen. Eine akute Depletion von Sgo2 und Securin (aber nicht die einzelnen Verluste) führen zu einer Deregulierung von Separase gefolgt von vorzeitigem Verlust der Schwesterchromatid-Kohäsion. 8) Der AAA-ATPase-Trip13 disassembliert den Separase-Sgo2-Mad2-Komplex nach SACInaktivierung in der Metaphase. Während also der kanonische, Securin-abhängige Zweig der Anaphasekontrolle Proteolyse erfordert, tut dies die Freisetzung aktiver Separase von Sgo2-Mad2 nicht. 9) Humane Separase fördert die Reparatur von DNS Doppelstrangbrüchen (DSBs) durch homologe Rekombination. Eine Reihe von posttranslationalen Modifikationen führt zur Rekrutierung von Separase aus dem Zytoplasma hin zu DSBs. Hier wird Separase aktiviert und spaltet lokal Cohesin. Dies könnte der Reparaturmaschinerie den Zugang zur beschädigten DNS erleichtern. 10) Die Spaltung von Mcl1 und Bcl-xL durch Separase wandelt diese anti-apoptotischen Faktoren in pro-apoptotische Fragmente um und löst über den intrinsischen Weg der Apoptose den Tod in Mitose aus. Das C-terminale Spaltfragment von Mcl1 bildet Cytochrom c leitende Poren in der mitochondrialen Außenmembran, eine Fähigkeit, von der man bisher annahm, dass sie auf Bak und Bax beschränkt ist. 11) Mcl1 und Bcl-xL sind nur dann Substrate für Separase, wenn sie durch Nek2a phosphoryliert vorliegen. Eine gleichzeitige Aktivität beider Enzyme tritt nur dann auf, wenn die Zellen aufgrund eines pathologischen Verlustes des SAC ungehindert schnell durch die Mitose gehen. Nek2a und Separase stellen daher einen 'minimal duration of early mitosis checkpoint' (DMC) dar, welcher die Apoptose von Zellen auslöst, die ansonsten zur Chromosomen-Fehlsegregation verdammt wären.