Spider Silk Scaffolds as a Material for new Biomedical Applications

Titelangaben

Aigner, Tamara B.:
Spider Silk Scaffolds as a Material for new Biomedical Applications.
Bayreuth , 2020 . - 209 S.
( Dissertation, 2020 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Biomedical engineering arose out of the collaboration of medical doctors, biologists and engineers and substantially accelerated advances in medicine. Researchers in this field strive to improve medical care through the development of diagnostic tools and devices, prosthetics, surgical tools and robots, and tissue engineering. The latter one seeks regeneration or restoration of a damaged or diseased tissue. Materials used on or in human body must fulfill several divergent requirements. Firstly, they should provide mechanical support by offering sufficient mechanical strength, on a scale commonly found in synthetic polymers. Secondly, they should be biologically compatible and for instance trigger cell recognition usually attributed to natural polymers. One material type that captures both requirements are spider silk-based materials. Their unique chemistry and structure give spider silk fibers extraordinary mechanical properties and no immune response is induced in the body. Inherent cell recognition (eukaryotic and prokaryotic) of most native spider silks is poor, but if required, cell binding motives can be added using a biotechnological approach to produce recombinant spider silk proteins, which can further be processed into various morphologies. The objective of this dissertation was to exploit the beneficial properties of coatings, films, nonwovens and self-rolling bilayers made of recombinant spider silk proteins to widen the scope of their use in biomedical engineering. Spider silk scaffolds were investigated for loading with bioactive agents, use in heart muscle and nerve regeneration and as enzyme container. Accurate delivery of sensitive biological substances can improve cell behavior on scaffolds for tissue engineering. In the first project electrospun nanofibers with their inherent advantages of high porosity and surface-to-volume ratio were loaded with green fluorescent protein (GFP) as a bioactive agent model. Its fluorescence is structure dependent and common solvents used for electrospinning and post-treatment of silk destroyed GFP’s structure. Therefore, an aqueous electrospinning and post-treatment process was developed, which allowed a mild encapsulation and kept the structural integrity of GFP. The fast release of GFP could be inhibited or slowed down by genetic modification giving the system a broader application window. Post-surgical infections are a life-threatening risk and the increase in antibiotic resistant bacteria prove the need for alternatives. The second project investigated the antibacterial properties of spider silk coated selenium nanoparticles alone and encapsulated in silk films. Selenium nanoparticles are effective against gram-positive bacteria. By applying a coating of spider silk, the scope could be widened to gram-negative bacteria. Low doses of the coated nanoparticles killed Escherichia coli without impairing eukaryotic cell viability. The body’s capability of cardiac repair after a myocardial infarct is poor and materials to assist cardiac regeneration are desperately needed. Thus, in the third project, the behavior of primary cardiac cells on spider silk films was investigated. The secondary structure content and the water contact angle of these films was found to be in a suitable range. Cell studies showed that silk films are non-toxic and provoke no pharmacologic effect. Furthermore, cardiac cells grown on these silk films showed required cell-to-cell communication and responded properly to extracellular stimuli, thus, laying the foundation for use of silk in cardiac tissue engineering. Injuries of the peripheral nerve system still show an inacceptable recovery rate. Thus, in the fourth project, bilayers of spider silk and chitosan were self-rolled into tubular structures to act as nerve guidance conduits. The tubes were either lined with a silk film containing a cell-recognition motif or aligned silk nanofibers, or an anisotropic collagen cryogel was encapsulated filling out the luminal space. The mechanical properties of the collagen cryogel are in the range of healthy peripheral nerves. Nerve cells could be entrapped by the gentle rolling process and their differentiation was achieved inside of the tubes, allowing the formation of neurite outgrowths. The aligned structures even triggered orientation of these neurite outgrowths in longitudinal direction, as is required in nerve repair. In the fifth project, these self-rolling tubular structures were optimized to encapsulate enzymes. They were shown to be stable in relevant organic and aqueous solutions and to possess a molecular weight cut-off above 20 kDa. Hence, these enzyme containers allowed the entrapment of enzymes, while substrates, intermediates and/or products can diffuse freely through the tube wall. This allowed to exchange the surrounding media without removing the enzymes, thereby saving often costly enzymes and enabling the design of a flow-through system. Reaction rates were slowed down, but longer reaction times were observed. Thus, this system can protect enzymes and may be useful for applications in biodiagnostics. Through this work, we showed that recombinant spider silk-based materials have a high potential in several fields of biomedical engineering. The processability into various morphologies and the precise control over the protein sequence makes it an interesting option for diverse applications. This thesis only gives a small glimpse at the scope of possibilities and more is yet to come.

Abstract in weiterer Sprache

Die Biomedizintechnik entstand durch die Zusammenarbeit von Ärzten, Biologen und Ingenieuren und beschleunigte so signifikant die Weiterentwicklung der modernen Medizin. Wissenschaftler in diesem Bereich streben eine Verbesserung des Gesundheitssystems durch die Entwicklung von Diagnoseinstrumenten, Prosthesen, chirurgischen Werkzeugen/Robotern und Geweberegeneration an, welche auf eine komplette Regeneration oder Wiederherstellung von geschädigtem oder erkranktem Gewebe abzielt. Materialien, welche am und im Körper eingesetzten werden, müssen viele divergente Anforderungen erfüllen. Einerseits sollten sie mechanische Stabilität in einem Bereich bieten, der üblicherweise bei synthetischen Polymeren zu finden ist. Andererseits sollten die Polymere biokompatibel sein und zum Beispiel von Zellen erkannt werden, ein Attribut, dass üblicherweise natürlichen Polymeren zugeschrieben wird. Bei einer Materialart verschwimmen diese Grenzen, da es die Vorteile von beiden Seiten vereint – spinnenseidenbasierte Materialien. Die einzigartige Chemie und Struktur verleiht Spinnenseidenfasern außergewöhnliche mechanische Eigenschaften und zusätzlich lösen sie keine Immunantwort aus. Die meisten natürlichen Spinnenseiden werden weder von eukaryotischen noch von prokaryotischen Zellen erkannt. Durch die Entwicklung eines biotechnologischen Prozesses zur Herstellung rekombinanter Seidenproteine, können, wenn gewünscht, zellbindende Motive genetisch hinzugefügt werden. Auch können rekombinante Seidenproteine in verschiedene Morphologien prozessiert werden. Ziel dieser Arbeit war es, die vorteilhaften Eigenschaften von Beschichtungen, Filmen, Vliesen und selbstrollenden Röhrchen basierend auf rekombinant hergestellten Spinnenseidenproteinen zu nutzen, um deren Anwendungsmöglichkeiten in der Biomedizintechnik auszuweiten. Spinnenseidengerüste wurden mit bioaktiven Substanzen beladen, für die Anwendung in der Herzmuskelregeneration, als Nervenleitstruktur, sowie als Enzymkontainer untersucht. Präzise Positionierung sensibler bioaktiver Substanzen kann das Zellverhalten an Gerüststrukturen für die Geweberekonstruktion verbessern. Im ersten Projekt wurden elektrogesponnene Nanofasern, welche nicht nur eine vorteilhafte hohe Porosität, sondern auch ein hohes Oberflächen-Volumen-Verhältnis aufweisen, mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) als Modell für bioaktive Moleküle beladen. Die GFP Fluoreszenz ist strukturabhängig und gängige Lösungsmittel fürs Elektrospinnen und die Nachbehandlung von Seidennanofasern zerstören diese. Deshalb wurde ein wässriges Spinn- und Nachbehandlungsverfahren entwickelt, welches eine sanfte Verkapselung und somit die Erhaltung der GFP Struktur ermöglichte. Die rasche Freisetzung des GFP konnte mit Hilfe genetischer Modifikation verhindert oder deutlich verlangsamt werden und ermöglicht somit dem System einen breiteren Anwendungsbereich. Postoperative Infektionen sind ein lebensbedrohendes Risiko und die rapide Vermehrung antibiotikaresistenter Keime erfordern die Entwicklung von Alternativen. Das zweite Projekt untersuchte die antibakteriellen Eigenschaften von seidenbeschichteten Selen-Nanopartikeln allein und eingebettet in Seidenfilmen. Die Wirkung gegen gram-positive Bakterien der Selen-Nanopartikel konnte durch die Beschichtung mit Spinnenseide auch auf gram-negative Bakterien ausgeweitet werden. Schon kleinste Dosen der beschichteten Nanopartikel töteten erfolgreich Escherichia coli, ohne einen schädlichen Einfluss auf eukaryotische Zellen aufzuweisen. Die Fähigkeit des menschlichen Körpers, den Herzmuskel nach einem Herzinfarkt zu regenerieren, ist nicht vorhanden und es werden händeringend neue Materialien zur Förderung der Regeneration gesucht. Darum wurde im dritten Projekt das Zellverhalten von primären Herzmuskelzellen auf unterschiedlichen Seidenfilmen untersucht. Die Zusammensetzung der Sekundärstruktur sowie der Wasserkontaktwinkel waren in einem geeigneten Bereich. Es konnte gezeigt werden, dass Seidenfilme weder giftig sind noch pharmakologische Effekte hervorrufen. Zusätzlich zeigten die auf den Filmen wachsenden Herzmuskelzellen für das Herz notwendige Zell-Zell-Kommunikation und reagierten angemessen auf extrazelluläre Stimulation, wodurch die Grundlage für die Verwendung von rekombinanten Spinnenseidenmaterialien in der Herzmuskelgeweberegeneration gelegt werden konnte. Verletzungen peripherer Nerven zeigen noch immer einen inakzeptablen Genesungsgrad. Im vierten Projekt wurden daher Röhrchen durch einen selbstrollenden Mechanismus von einer Doppelschicht aus Spinnenseide und Chitosan hergestellt, um als Nervenleitstruktur zu agieren. Dafür wurden die Röhrchen entweder mit einem Seidenfilm mit zellbindendem Peptid oder mit ausgerichteten elektrogesponnenen Nanofasern ausgekleidet, oder ein anisotropes Kollagen Cryogel wurde umrollt, wodurch der gesamte Hohlraum ausgefüllt wurde. Die mechanischen Eigenschaften von Kollagen Cryogelen lagen im Bereich von gesunden peripheren Nerven. Durch den sanften Roll-Prozess konnten Nervenzellen behutsam eingefangen und direkt in den Röllchen differenziert werden. Die ausgerichteten Nanofasern und die Cryogele ermöglichten sogar die Ausbildung von gerichtetem Neuriten-Auswuchs, welcher in der Nervenregeneration nötig ist. Im fünften Projekt wurden diese selbstrollenden Röhrchen optimiert, um Enzyme darin einzuschließen. Es konnte gezeigt werden, dass die Röhrchen stabil sind gegenüber relevanten organischen und wässrigen Lösungen und die Diffusion von Molekülen über 20 kDa verhindern. Daher konnten Enzyme eingeschlossen werden, wobei deren Substrate, Intermediate und/oder Produkte durch die Wand der Röhrchen diffundieren konnten. Die Enzymkontainer ermöglichten den Austausch des umgebenden Mediums, ohne das Enzyme zu entfernen, wodurch nicht nur oft teure Enzyme gespart werden, sondern auch Durchflusssysteme generiert werden könnten. Die Reaktionsraten wurden durch die doppelte Diffusion verlangsamt, dafür konnten längere Reaktionszeiten beobachtet werden. Somit kann dieses System eingesetzt werden, um Enzyme zu schützen. Weitere Anwendungen im Bereich der Biodiagnose wären denkbar. In dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass Materialien aus rekombinanten Spinnenseidenproteinen hohes Potential in verschiedenen Bereichen der Biomedizintechnik aufweisen. Die Möglichkeit, Spinnenseide in verschiedenste Morphologien zu verarbeiten, kombiniert mit der Fähigkeit, die Sequenz der Spinnenseide präzise kontrollieren zu können, macht Spinnenseide zu einem interessanten Material für unterschiedliche Anwendungen. Diese Arbeit gibt nur einen kleinen Einblick in die Vielfalt an Anwendungsmöglichkeiten, und viele weitere spannende Entwicklungen werden erwartet.