Die extrazelluläre Domäne der humanen Guanylatzyklase C und ihre Liganden: Rekombinante Expression, strukturelle Charakterisierung und Aktivitätsbestimmung

Titelangaben

Weiglmeier, Philipp Richard:
Die extrazelluläre Domäne der humanen Guanylatzyklase C und ihre Liganden: Rekombinante Expression, strukturelle Charakterisierung und Aktivitätsbestimmung.
Bayreuth , 2014 . - VI, 215 S.
( Dissertation, 2014 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

Volltext

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Abstract

Die Wechselwirkung der intestinalen Guanylatzyklase C (GC-C) mit den Peptidhormonen Guanylin und Uroguanylin sowie dem bakteriellen hitzestabilen Enterotoxin STh ist von entscheidender Bedeutung für die Regulation des Elektrolyt- und Wasserhaushalts im Dünndarm. Guanylin, Uroguanylin und STh sind 15 bis 19 Aminosäuren lange, disulfidreiche Peptide. Ihre Bindung an die extrazelluläre Domäne (ECD) von GC-C führt zur Aktivierung von deren intrazellulärer katalytischer Guanlyatzyklasedomäne und resultiert in einer durch zyklisches Guanosin-3',5'-monophosphat (cGMP) vermittelten Sekretion von Anionen ins Darmlumen. Die Rolle der STh/GC‑C‑Interaktion bei der durch enterotoxigene Escherichia coli (ETEC) induzierten akuten sekretorischen Diarrhoe und die erst kürzlich gemachte Beobachtung, dass die Aktivierung von GC‑C durch ihre Liganden eine verminderte Inzidenz von kolorektalem Krebs nach sich zieht, machen GC-C zu einem vielversprechenden Ansatzpunkt innovativer Therapien. Um zum Verständnis der molekularen Grundlagen der Rezeptor/Ligand-Wechselwirkung beizutragen und als Voraussetzung für weiterführende Bindungsstudien, wurden in dieser Arbeit effiziente Protokolle zur rekombinanten Expression und Reinigung der GC-C-Liganden Uroguanylin und STh entwickelt. Außerdem wurden mutierte Varianten beider Peptide exprimiert und charakterisiert. Des Weiteren wurden mehrere rekombinante Expressionssysteme, basierend auf Escherichia coli, der Hefe Pichia pastoris und Säugerzellen, auf ihre Eignung zur Expression der extrazellulären Rezeptordomäne von GC-C oder eines geeigneten, zur Ligandenbindung befähigten Rezeptorfragments hin untersucht. Guanylin und Uroguanylin werden in vivo als Prohormone exprimiert, wobei die Rolle des Propeptids darin besteht, die biologisch aktive Konformation der Hormonsequenz zu stabilisieren und die Ausbildung der nativen Disulfidverbrückung zu ermöglichen. Aus diesen Prohormonen werden die jeweiligen Hormone proteolytisch freigesetzt. In einem ersten Schritt wurde Uroguanylin hergestellt, indem das Vorläuferprotein Prouroguanylin rekombinant exprimiert, gereinigt und tryptisch verdaut wurde. Durch NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass das aus dem Spaltansatz gereinigte Peptid die gleichen chemischen Verschiebungen aufwies wie biologisch aktives Uroguanylin. Zusammen mit dem massenspektrometrischen Nachweis der beiden im Peptid enthaltenen Disulfidbrücken diente dies als Bestätigung, dass das gereinigte Uroguanylin die korrekte Konformation annahm. Zur rekombinanten Expression von biologisch aktivem hitzestabilem Enterotoxin STh wurde seine große strukturelle Ähnlichkeit zu Uroguanylin ausgenutzt und ein chimäres Vorläuferprotein, bestehend aus dem N-terminalen Propeptid von Prouroguanylin und der Aminosäuresequenz von STh, entwickelt. Dieses neue Fusionsprotein wurde Prouro-STh genannt. Analog zur Situation in Prouroguanylin, in der das Propeptid die Faltung von Uroguanylin und die Ausbildung der Disulfidbrücken ermöglicht, sollte auch innerhalb des Fusionsproteins Prouro-STh die Bildung des korrekten Disulfidverbrückungsmusters unterstützt werden. Rekombinantes STh konnte in guter Ausbeute und Reinheit isoliert und anschließend strukturell charakterisiert werden (Weiglmeier et al., 2013). Mit einem in‑vitro-Aktivitätsassay wurde die biologische Aktivität von beiden rekombinanten Peptiden, Uroguanylin und STh, nachgewiesen. Dass sich das in dieser Arbeit etablierte Expressionssystem auch zur Herstellung anderer, von Uroguanylin und STh abgeleiteter Agonisten der GC-C eignet, wurde durch die erfolgreiche Expression und Reinigung der Varianten Uroguanylin A3R D6E, STh L9Y und STh Y5R L9Y gezeigt. Das Propeptid toleriert die Punktmutationen innerhalb der Zielsequenz (Uroguanylin bzw. STh) ohne dass der Propeptid-unterstützte Faltungsmechanismus beeinträchtigt wäre. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde zunächst das Rezeptorfragment MiniGC-C, das mit einer Länge von 197 Aminosäuren der membrannahen Subdomäne der ECD entspricht, in E. coli exprimiert. MiniGC-C ist löslich und strukturiert und konnte in guter Ausbeute gereinigt werden. Jedoch wurde in NMR‑Titrationsexperimenten weder eine Wechselwirkung mit Uroguanylin noch mit STh beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Ligandenbindung entgegen anderslautender Voraussagen nicht ausschließlich von der membrannahen Subdomäne vermittelt wird. Zur Expression der gesamten extrazellulären Domäne von GC-C wurden Protokolle für E. coli, die methylotrophe Hefe Pichia pastoris sowie Säugerzellkultur entwickelt und evaluiert. Die beiden in E. coli exprimierten Konstrukte Trx-ECD-GC-C und NusA‑Cys‑‑ECD‑GC‑C waren aufgrund von minimaler Löslichkeit einerseits und offensichtlicher Fehlfaltung und Oligomerisierung andererseits nicht geeignet, die Liganden von GC-C zu binden. Die ECD von GC-C wurde in P. pastoris und in Säugerzellen exprimiert, jedoch waren in beiden Fällen die Ausbeuten der Expressionen nur sehr gering. Darüber hinaus unterlagen beide Konstrukte proteolytischem Abbau und konnten nach einigen Reinigungsschritten nicht mehr detektiert werden. Obwohl es in dieser Arbeit nicht möglich war, ein lösliches, strukturiertes und zur Ligandenbindung befähigtes Fragment von GC-C in reiner Form herzustellen, stellen die evaluierten Expressions- und Reinigungsprotokolle doch eine Grundlage für zukünftige Anstrengungen zum Erreichen dieses Ziels dar. Insbesondere ist hervorzuheben, dass mit der hier entwickelten relativ einfachen und kostengünstigen Methode zur Produktion und Isotopenmarkierung von Agonisten der GC-C, ein wichtiges Werkzeug für die NMR-spektroskopische Charakterisierung der Rezeptor/Ligand-Wechselwirkung der GC-C zur Verfügung steht. Da außerdem das pharmakologische Potential von Uroguanylin- und STh-Varianten zunehmend in den Fokus der Forschung rückt, sind die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Ergebnisse ein wichtiger Beitrag zur Wirkstoffentwicklung.

Abstract in weiterer Sprache

The interaction of intestinal guanylyl cyclase C (GC-C) with the peptide hormones guanylin and uroguanylin and the bacterial heat-stable enterotoxin STh is of eminent importance for the maintenance of electrolyte and water homeostasis in the small intestine. Guanylin, uroguanylin and STh are peptides with a length of 15 to 19 amino acids and are rich in cystines. The binding of these peptides to the extracellular domain (ECD) of GC-C activates its intracellular guanylyl cyclase domain and triggers a cGMP-mediated secretion of anions into the intestinal lumen. GC-C is a promising target for innovative therapeutic strategies. This is illustrated by the role of the STh/GC-C interaction in acute secretary diarrheal diseases caused by enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) infection as well as by the recent finding that GC-C activation by its ligands is correlated with a diminished incidence of colorectal carcinoma. In order to contribute to a better understanding of the molecular basis of this receptor/ligand interaction and to lay the foundations for further binding studies, efficient protocols for the recombinant expression and purification of the GC-C agonists uroguanylin and STh were developed in the present work. Furthermore, several recombinant expression systems, based on Escherichia coli, the yeast Pichia pastoris as well as mammalian cell lines, were explored with respect to their suitability to express the entire ECD of GC‑C or a receptor fragment that is able to bind GC-C's ligands. In vivo, guanylin and uroguanylin are expressed as pro-hormones. The role of the pro-peptide is to stabilize the biologically active conformation of the hormones and thereby to render possible the formation of the native disulfide linkages. The hormones are released from the respective pro-hormones by proteolytic cleavage. As a first step, uroguanylin was produced by recombinant expression, purification and tryptic digestion of the precursor protein prouroguanylin. NMR spectroscopy could show that the purified, recombinant peptide had chemical shifts consistent with biologically active uroguanylin. The presence of uroguanylin's two disulfide bonds was confirmed by mass spectrometry. These findings showed that the purified uroguanylin adopts its native conformation. For the recombinant expression of biologically active heat-stable enterotoxin STh its considerable structural similarity to uroguanylin was used and a chimeric precursor protein consisting of the N‑terminal pro-peptide of prouroguanylin and the amino acid sequence of STh was developed. This novel fusion protein was termed Prouro-STh. The formation of the native disulfide bond pattern of STh should be supported in the context of the fusion protein Prouro-STh in a way very similar to the situation in prouroguanylin. Using this approach, recombinant STh could be obtained in good yield and purity and was subsequently characterized (Weiglmeier et al., 2013). The biological activity of both recombinant peptides, uroguanylin and STh, was confirmed by an in vitro activity assay. The expression system established in the present work can be used for the production of other GC-C agonists derived from uroguanylin and STh. This has been shown by the successful expression and purification of the mutant variants uroguanylin D3R D6E, STh L9Y and STh Y5R L9Y. The pro‑peptide tolerates the newly introduced point mutations in its target, i. e. the uroguanylin or STh, without any apparent impediment on pro-peptide mediated folding. In the second part of this work the receptor fragment MiniGC-C was expressed in E. coli. MiniGC‑C has a length of 197 amino acids and corresponds to the membrane proximal subdomain of the ECD. MiniGC-C is a folded soluble protein that can be purified at a high yield. However, NMR titration experiments were unable to confirm any interaction between MiniGC-C and uroguanylin or STh, respectively. This observation leads to the conclusion that, despite predictions to the contrary, the interaction between the ligands and the ECD is not solely mediated by the latter's membran proximal subdomain. Several protocols for the expression of the entire ECD of GC-C in either E. coli, the methylotrophic yeast Pichia pastoris or mammalian cell culture were developed and evaluated. The constructs Trx-ECD-GC-C and NusA‑Cys‑‑ECD‑GC‑C, which were used for expression in E. coli, were not suitable for ligand binding. While Trx-ECD-GC-C was completely unsoluble the NusA‑Cys‑‑ECD‑GC‑C fusion protein turned out to be misfolded and formed non-native oligomers. The ECD was expressed in P. pastoris and mammalian cell culture. However, the yield of expressed protein in both systems was low. Moreover, both constructs were quite unstable and were lost due to degradation during purification. Although it was not possible to obtain a soluble well-folded and pure fragment of GC-C which retains the ability to bind GC-C's ligands the purification protocols evaluated in the present work offer nevertheless a basis and novel starting point for future efforts to achieve this goal. It should be highlighted that the relatively easy and inexpensive method for production and isotopic labeling of agonists of GC-C developed here is an important tool for the NMR spectroscopic characterization of receptor/ligand interactions involving GC-C. Because of the recent focus on the pharmacological potential of uroguanylin and STh variants the results presented in this work constitute an important contribution to the development of new active pharmaceutical ingredients.