Elektrochemische Detektion von RNA mittels Nukleinsäurehybridisierung

Titelangaben

Pöhlmann, Christopher:
Elektrochemische Detektion von RNA mittels Nukleinsäurehybridisierung.
Bayreuth , 2009
( Dissertation, 2010 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die Nukleinsäureanalytik, insbesondere die RNA-Analytik, ist ein wichtiges Werkzeug für die Diagnostik von pathogenen Mikroorganismen in der Medizin und Lebensmittelüberwachung. Weiterhin besitzt der Nachweis von RNA-Molekülen bei der Transkriptomanalytik in der Grundlagenforschung eine zentrale Bedeutung. Ziel der Arbeit war die Entwicklung neuartiger Detektionsverfahren für unterschiedliche RNA-Spezies. Die schnelle und einfache Durchführbarkeit, aber auch die Parameter Selektivität und Sensitivität der entwickelten Techniken waren dabei von besonderer Bedeutung. Zunächst wurde die Detektionsmethode anhand der Identifizierung von Mikroorganismen mittels 16S rRNA-Sandwich-Hybridisierung etabliert und optimiert. Mit Hilfe von 16S rRNA-Sequenzdatenbanken wurden geeignete Sondensequenzen zur spezifischen Erkennung von verschiedenen Bakterien ermittelt. Die prokaryontische 16S rRNA wurde unter Verwendung des thermostabilen Reporterenzyms Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius durch eine Ein-Schritt Sandwich-Hybridisierung nachgewiesen. Ein Spezies-spezifisches Oligodesoxynukleotid wird auf der Goldelektrode eines elektrochemisch-auslesbaren Biochips immobilisiert und bindet die bakterielle 16S rRNA. Zeitgleich bindet ein kovalentes Konjugat aus Esterase 2 und Detektions-Oligodesoxynukleotid an einem konservierten Bereich der 16S rRNA. Nach Optimierung dieses Nachweissystems wurde eine Nachweisgrenze von 500 Kolonie bildenden Einheiten Escherichia coli ermittelt. Neben der guten Sensitivität konnte eine gute Spezifität bis hin zur Stammdiskriminierung gezeigt werden. Gleichzeitig konnten mehrere Bakterien in einem Ansatz identifiziert werden. Die Validierung dieses neuartigen bakteriellen Nachweissystems erfolgte mit realen Fleischproben. Das Hygienerecht der EU verlangt die Kontrolle mikrobiologischer Kriterien während der gesamten Prozesskette der Lebensmittelherstellung. Klassische mikrobiologische Verfahren sind hierfür jedoch nur bedingt geeignet. Biosensoren in integrierten Analysesystemen könnten in Zukunft hierfür Verwendung finden und die Analytik beschleunigen und vereinfachen. Die Optimierung der Probenvorbereitung und der Biochipmessung führte zu einem Gesamtanalyseprozess, bestehend aus Kurzanreicherung, RNA-Isolierung und Biochipmessung, welcher den spezifischen E. coli Nachweis von einer Kolonie bildenden Einheit pro mL Probe innerhalb von sieben Stunden ermöglicht. Daher ist diese Methode prinzipiell sehr gut für die Anwendung in der Lebensmittelproduktion geeignet. Eine Signalamplifikation der elektrochemischen Nukleinsäuredetektion wurde durch Herstellung eines neuartigen Reporterenzymkonjugats erreicht. Dazu wurden mehrere Esterase 2-Moleküle auf der Oberfläche eines Polyamidoamin-Dendrimers der Generation 3 verankert, während ein Detektions-Oligodesoxynukleotid mit dem Kern des Dendrimers kovalent verknüpft wurde. Die Selektivität der Bakterienidentifizierung blieb bei Verwendung dieses Reporterenzymkonjugats unverändert gut. Jedoch wurde bei Verwendung des mehrfach markierten Dendrimers eine Nachweisgrenze von 50 Kolonie bildenden Einheiten Escherichia coli erreicht, was eine zehnfache Verbesserung der Nachweisgrenze im Vergleich zum vorher beschriebenen Esterase 2-Oligodesoxynukleotid-Konjugat darstellt. Derzeit stellt die schnelle und sensitive Expressionsanalyse von microRNAs eine große Herausforderung dar. Kürzlich wurde zudem gezeigt, dass diese als Biomarker für die Tumordiagnostik dienen können. Deshalb wurde auf Basis des etablierten Sandwich-Hybridisierungssystems ein so genannter Lückenhybridisierungsnachweis entwickelt. Eine Hybridisierung von immobilisiertem Fänger-Oligodesoxynukleotid, Esterase 2-Detektionsoligodesoxynukleotid und komplementärer RNA-Probe lässt eine Lücke zwischen Fänger- und Detektionssonde. Diese Lücke destabilisiert den Komplex, was bei höheren Temperaturen zu einem Zerfall führt. Ist dagegen die gewünschte microRNA anwesend, füllt diese die Lücke zwischen Fänger- und Detektionssonde aus, stabilisiert den Hybridisierungskomplex und immobilisiert das Reporterenzym in der Nähe der Elektrode. Dieses kann folglich elektrochemisch detektiert werden. Mittels Lückenhybridisierung konnten verschiedene microRNAs diskriminiert werden. Selbst einzelne Fehlbasenpaarungen führten zu einem signifikanten Signalabfall. Die Nachweisgrenze für microRNA beträgt 2 pM bzw. 2 attomol ohne jegliche vorherige Amplifikation der Nukleinsäuren. Nach Isolation der Gesamt-RNA aus einer humanen Mammakarzinomzelllinie konnte mit dieser Methode ein Expressionsprofil von vier verschiedenen microRNAs innerhalb von 60 Minuten erstellt werden. Die Methode der Lückenhybridisierung wurde auch erfolgreich auf die schnelle Expressionsanalyse von Boten-RNAs aus prokaryontischen und eukaryontischen Zellen angewandt.

Abstract in weiterer Sprache

Electrochemical biochips are an emerging tool for point-of-care diagnostic systems in medicine, food and environmental monitoring. Aim of this study was the development of a novel detection platform for different RNA species. Besides versatility, rapid operation and broad applicability, the parameters sensitivity and selectivity were the focus of present investigation. A thermostable reporter enzyme, esterase 2 from Alicyclobacillus acidocaldarius, was used for specific and sensitive detection of bacteria by one-step rRNA/DNA hybridization between a bacterium-specific capture oligodeoxynucleotide, bacterial 16S rRNA and an uniform esterase 2-oligodeoxynucleotide reporter conjugate. The detection limit corresponds to approximately 500 colony forming units Escherichia coli. Beside high sensitivity, the application of electrochemical biochips allows discrimination of two Gram-negative and two Gram-positive bacteria demonstrating the specificity and the potential for parallel detection of microorganisms. The feasibility of identification of foodborne bacteria was studied with meat juice contaminated with Escherichia coli. This detection system has the capability to be applied for monitoring of bacterial food contamination. According EU hygiene guidelines control of microbiological monitoring has to be applied throughout the whole process of food manufacturing. While classical microbiological methods are less suitable for routine analysis, biosensors integrated in lab-on-a-chip systems could help to improve the situation in future. Therefore, we tested the applicability of biosensors for the detection of bacteria in food by means of direct and specific electrochemical detection of microbial 16S ribosomal RNA. E. coli contaminated meat matrix was analysed. We developed a procedure, including a short preenrichment step followed by an optimized RNA isolation and biochip measurement that enabled E. coli detection of at least 1 colony forming units per mL sample within 7 hours. This diagnostic procedure is well suited for application in food production monitoring. In order to improve sensitivity of Escherichia coli 16S rRNA detection novel enzyme-oligodeoxynucleotide conjugate was synthesized. Thermostable esterase 2 from Alicyclobacillus acidocaldarius was multiply conjugated to a polyamidoamine dendrimer functionalized by one universal detector oligodeoxynucleotide. Three components rRNA/DNA hybridization between capture oligodeoxynucleotide covalently immobilized on a gold electrode, 16S rRNA and the multivalent esterase-dendrimer cluster were used for detection. The linear dependence of the electrochemical signals to analyte concentration revealed a detection limit of 50 colony forming units Escherichia coli, which represents a tenfold signal enhancement as compared to the detection limit achieved with monovalent esterase-oligodeoxynucleotide conjugate. MicroRNAs have recently been linked to cancerogenesis by acting as tumor-suppressors or oncogenes. Therefore, they could be used as molecular markers for early diagnosis of cancer. In this work, a rapid, selective and sensitive gap hybridization assay for detection of mature microRNAs based on four components DNA/RNA hybridization and electrochemical detection using esterase 2-oligodeoxynucleotide conjugates was established. Complementar binding of microRNA to an RNA probe and to a gap built of capture and detector oligodeoxynucleotide the reporter enzyme is brought to vicinity of electrode to produce an electrochemical signal. In absence of microRNA the gap between capture and detector oligodeoxynucleotide is not filled and missing base stacking energy destabilizes the hybridization complex. The gap hybridization assay demonstrates selective detection of miR-16 within a mixture of other miRNAs including possibility of single mismatch discrimination. Applying the biosensor assay a detection limit of 2 pM or 2 amol of miR-16 was obtained. Using isolated total RNA from human breast adenocarcinoma MCF-7 cells the assay detected specifically miR-21 and miR-16 in parallel and higher expression of oncogene miR-21 as compared to miR-16 was demonstrated. Including RNA isolation the gap hybridization assay was developed with a total assay time of 60 min and without the need for reverse transcription PCR amplification of the sample. Same principle was applied for messenger RNA expression analysis in prokaryotic and eukaryotic cells. The characteristics of the assay developed in this work could satisfy the need for rapid and easy methods for early cancer marker detection in clinical diagnostics.