Die Regulation der Transkriptionsantitermination in Escherichia Coli.

Titelangaben

Burmann, Björn:
Die Regulation der Transkriptionsantitermination in Escherichia Coli.
Bayreuth , 2009
( Dissertation, 2010 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die Transkription wird in den Zellen durch die RNA-Polymerasen (RNAP) katalysiert. Die bakterielle RNAP ist aus den zwei alpha, beta´, beta, omega-Untereinheiten aufgebaut. Das katalytische Zentrum wird durch die beta’- und beta-Untereinheit gebildet und sorgt für die Bildung der Phosphodiesterbindung. Die alpha- und omega-Untereinheiten sind für den korrekten Aufbau der RNAP verantwortlich, wobei Teile der alpha-Untereinheiten zusätzlich regulatorische Funktionen haben. Der Ablauf der Transkription ist in Initiation, Elongation und Termination unterteilt. Alle drei Phasen werden innerhalb der Zellen streng reguliert. Während der Elongation bewirkt die sogenannte Antitermination das Überlesen von Terminationssequenzen. Dieser zuerst beim Phagen Lambda identifizierte Mechanismus, beruht auf dem Aufbau eines Multi-Protein-Komplexes, bestehend aus den Escherichia coli (E. coli) Nus-Proteinen (A, B, E, G), der RNAP, der nut RNA-Sequenz und dem Lambda N-Protein. Die ribosomalen (rrn) Operons in E. coli werden durch intrinsische Antitermination reguliert. Fluoreszenz-Anisotropie-Messungen konnten zeigen, dass die Bildung des NusB:NusE Heterodimers und seine Bindung an die boxA der nut und rrn RNA-Sequenzen ein wichtiger Schritt im Aufbau des Antiterminationskomplexes ist. Für die sogenannte NusB101-Mutation, Asp118Asn, die den negativen Effekt von Mutationen in anderen Komponenten des Komplexes aufheben kann, konnte eine höhere Affinität zur Erkennungs-RNA gezeigt werden. Weitere Mutationen an dieser Position zeigten, dass die Aminosäureposition 118 zentral für die Stabilität der RNA-Bindung ist. Ein weiterer Bestandteil des Antiterminationskomplex ist das zwei Domänenprotein NusG, über dessen Interaktion innerhalb des Komplexes wenig bekannt war. Interaktionen für die beiden Domänen, die das NusG-Paralog RfaH konstituieren, sind in der Literatur beschrieben, wie es auch bei der Kristallisation von NusG aus Aquifex aeolicus gezeigt werden konnte. Für E. coli NusG konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass diese Interaktion konzentrationsabhängig, damit intermolekular, und sehr kurzlebig ist. Zusätzlich konnten Proteinbindungsflächen auf beiden Domänen bestimmt werden. Als Erkenntnis von zentraler Wichtigkeit und sehr weitreichenden Konsequenzen wurde in dieser Arbeit eine spezifische und strukturell sehr gut definierte Wechsel-wirkung der carboxy-terminalen Domäne von NusG mit NusE, das unter der Bezeichnung S10 auch ein Bestandteil der 30S Untereinheit des Ribosoms ist, identifiziert. Seit wenigen Wochen ist in der Literatur die Interaktion der amino-terminalen Domäne von NusG mit der RNA-Polymerase beschrieben. Die hier beobachtete Wechselwirkung der carboxy-terminalen Domäne von NusG mit NusE könnte damit zur Rekrutierung des NusB:NusE Heterodimers und zur Ausbildung eines kompakten Antiterminationskomplexes beitragen. Da NusE auch Teil des Ribosoms ist, stellt die NusG:NusE Interaktion möglicherweise die erste direkte molekulare Verbindung zwischen Transkription und Translation in Bakterien dar. Diese Kopplung von bakterieller Transkription und Translation ist ein sehr lange bekanntes, aber molekular nicht erklärtes Phänomen von außerordentlicher Bedeutung für die Überlebensfähigkeit von Bakterien. In ähnlicher Weise, wie das Lambda N-Protein, aber mit entgegengesetzter Wirkung – Termination statt Antitermination – bindet das Nun-Protein aus dem Phagen HongKong 022 an die boxB, eine Haarnadelschleife der nut Sequenz. Durch in vivo Studien wurde die Nun Tyr39Ala Mutante, die wichtige Hinweise für das Verständnis der Peptid-RNA-Interaktion lieferte, identifiziert. Durch diese Mutation ist eine ursprünglich als wichtig angesehene Wechselwirkung mit dem Adenosin 9 der boxB nicht mehr möglich. Molekulardynamikuntersuchungen zeigen deutliche Unter-schiede zur Lambda N:boxB Wechselwirkung auf, da die analoge Trp18:A9 Interaktion essentiell für prozessive Antitermination ist. Auf diese Weise lieferte diese Untersuchung wichtige Hinweise auf den molekularen Schaltmechanismus.

Abstract in weiterer Sprache

The RNA-Polymerase (RNAP), the multidomain complex that catalyzes transcription, consists of the two alpha, beta´, beta, omega-subunits, where the beta’- and beta-subunits form the active center that catalyzes the RNA polymerization. The alpha- and omega-subunits account for the correct folding and assembly of the RNAP, whereas parts of the alpha-subunits perform additional regulatory functions. Transcription is subdivided into initiation, elongation, and termination, and all three phases are under tight control within the cells. Antitermination, a mechanism initially identified in the phage Lambda/Escherichia coli (E. coli) guest/host system, enables RNAP to read through transcription termination sites during elongation. Antitermination depends on the assembly of a multi protein complex, consisting of the E. coli Nus-factors A, B, E, and G, the RNAP, the nut RNA sequence, and the Lambda N-Protein. Ribosomal (rrn) operons in E. coli are also regulated by antitermination. It could be shown by fluorescence anisotropy measurements that the formation of the NusB:NusE heterodimer and its binding to boxA of the nut and rrn RNA-sequences is a crucial step in the assembly of the antitermination complex. For the so-called NusB101 mutant, Asp118Asn, which is a gain of function mutant that is able to compensate for nonfunctional mutations in other Nus-factors, tighter binding than wt to RNA could be demonstrated. Results obtained with additional mutants underscored that position 118 is crucial for the stability of the RNA binding. Another part of the antitermination complex is the two-domain protein NusG. About NusGs role within the complex little is known so far. Interactions between the two domains that constitute the NusG paralog RfaH are described in the literature, and a similar observation was described in Aquifex aeolicus NusG crystals. It could be shown here that for E. coli NusG this interaction is concentration dependent, that it is intermolecular, and only transiently populated. In addition protein-binding sites on both domains could be described. Central point to this work and with far-reaching consequences is the specific and structurally well-defined interaction between the carboxy-terminal domain of NusG and NusE. NusE is also part of the 30S subunit of the ribosome as ribosomal protein S10. The interaction between the amino-terminal domain of NusG and the RNAP was recently described in the literature. The observed interaction between the carboxy-terminal domain of NusG and NusE could recruit the NusB:NusE heterodimer and thus account for the assembly of a compact antitermination complex. As NusE is also part of the ribosome, this NusG:NusE interaction represents the first direct molecular link between transcription and translation in bacteria. This coupling of bacterial transcription and translation is a very well known phenomenon that, however, is not well understood, although it is of extraordinary importance for the viability of bacteria. Similar to Lambda N, but with the opposite effect – termination instead of antitermination –, Nun protein of phage HongKong 022 binds to boxB, a stem-loop structure of the nut sequence. By in vivo studies the functional Nun Tyr39Ala mutation was identified to have important implications for this boxB interaction. The interaction of Tyr39 with A9 of the boxB, which was judged to be crucial earlier, is no longer possible with this mutation. Molecular dynamic calculations showed significant differences to the Lambda N:boxB interaction, where the analogous Trp18:A9 interaction is essential for processive antitermination. Thus this analysis gave important clues about the molecular switch between antitermination and termination.