Analyse der physiologischen Funktion von Mitgliedern der Rieske-Typ Eisen-Schwefel-Proteinfamilie in der inneren Plastidenhülle

Titelangaben

Bartsch, Sandra:
Analyse der physiologischen Funktion von Mitgliedern der Rieske-Typ Eisen-Schwefel-Proteinfamilie in der inneren Plastidenhülle.
Bayreuth , 2010
( Dissertation, 2010 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Höher entwickelte Pflanzen enthalten eine Superfamilie von non-Häm Oxygenasen, deren Mitglieder über identische, konservierte Rieske- und mononukleare Fe-Bindungsdomänen verfügen. Diese Familie umfasst Tic55, PAO, CAO, CMO und ein 52 kDa schweres Protein (PTC52), welches in Assoziation mit dem Präkursor NADPH:Protochlorophyllid (Pchlid) Oxidoreduktase A (pPORA) Translocon vorliegt. Die Expression von AtCAO cDNA in Synechocystis, welches kein CAO-Gen enthält, führte zur Bildung von Chlorophyll b (Chl b) und geringen Mengen an Pchlid b. Pulse labeling Experimente mit dem isolierten PTC-Komplex und dem Pchlid Präkursor 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) zeigten, dass PTC52 als Pchlid a Oxygenase agiert. Die gekoppelte in vitro Transkription/Translation von Arabidopsis CAO (AtCAO) bzw. PTC52 (AtPTC52) cDNAs führte zur Bildung von katalytisch aktiven Proteinen, wobei CAO Chlid a in Chlid b umwandelte, wohingegen PTC52 die Umwandlung von Pchlid a zu Pchlid b katalysierte. In Kotyledonen von Gerste und Arabidopsis ist der Import von pPORA von Pchlid abhängig. Während der Membran-Passage interagiert pPORA mit Komponenten des PTC-Komplexes und bildet dabei sog. „junction“-Komplexe zwischen äußerer und innerer Plastidenhülle. CAO wird als größeres Präkursor-Protein synthetisiert, über den Standard-Import-Komplex in den Intermembran-Raum importiert und liegt in seiner prozessierten Form als intrinsisches Protein der Thylakoid-Membranen bzw. der inneren Plastidenhülle vor, wo es mit Tic40, Tic22 und Tic20 interagiert und einen neuen Tic-Subkomplex bildet. Weitere Analysen mit Chloroplasten der Chlorina Mutanten ch1-3 (kein funktionelles CAO-Gen; keine Akkumulation von Chl b bzw. LHC-Proteinen) zeigten keinen Import von pLhcb1 (= Präkursor des LHCII-Apoproteins) bzw. pLhcb4 (= Präkursor des CP29-Apoproteins). PTC52 wird als größeres, ca. 57 kDa schweres Vorstufenprotein synthetisiert, in Chloroplasten importiert und zur endgültigen Größe prozessiert. Das reife, 52 kDa schwere Protein wurde als intrinsisches Membranprotein der inneren Plastidenhülle identifiziert, wo es mit PTC130, PTC90, PTC16/Oep16 und PTC33/Toc33 interagiert und einen funktionellen Protein-Import-Komplex (PTC-Komplex) bildet. Während des substratabhängigen Imports von pPORA katalysiert PTC52 die Oxygenierung von Pchlid a zu Pchlid b. DEPC agiert, indem es konservierte His-Reste im Rieske-Fe-S-Cluster ethoxyformyliert. Während bei geringen DEPC-Konzentrationen allein der Import von pPORA inhibiert war, war dieser in Anwesenheit von 1 mM DEPC nicht nachweisbar, wohingegen die Translokation von Tic55-Import-Substraten um ca. 10 % verringert war. Dies bestätigte die Beteiligung der His-Reste am katalytischen Mechanismus von PTC52 und Teil des PTC-Komplexes. Anhand von zwei PTC52-knockout-Linien (SALK_011945 und SAIL_148.HC5) wurde gezeigt, dass loss-of-function-Mutationen im Arabidopsis PTC52-Gen zu einem embryoletalen Phänotyp führten, so dass heterozygote AtPTC52/Atptc52-Pflanzen zur Analyse der Bedeutung von PTC52 in planta herangezogen wurden. Diese Keimlinge waren empfindlicher gegenüber einer Belichtung, was durch die geringeren Mengen an „light-harvesting“ POR-Pchlid (LHPP) – Komplexen im Prolamellarkörper der Etioplasten erklärbar war. Durch Pigmentanalysen konnte sowohl Pchlid a als auch Pchlid b in Wildtyp-Keimlingen identifiziert werden, wobei deren relative Anteile in AtPTC52/Atptc52-Pflanzen in Richtung Pchlid a verschoben waren. Zusätzlich waren ein Rückgang der Chl-Akkumulation, ein verändertes Chl b/Chl a-Verhältnis und eine Verringerung der LHCII-Mengen während des frühen Ergrünens erkennbar. Mittels Affinitätschromatographie wurden Tic55, PTC52 und PAO als Thioredoxin (Trx)-Targets in der inneren Plastidenhülle identifiziert. Abgesehen von konservierten Rieske- und [2Fe-2S]-Clustern weisen diese Proteine ein CxxC-Motiv auf. Aktivitätsmessungen in An- bzw. Abwesenheit von stromalem Trx f bzw. Trx m lassen darauf schließen, dass PTC52 und PAO aus Gerste reversiblen Oxidations/Reduktionsvorgängen, vermittelt durch redox-aktive SH-Gruppen, unterliegen, wobei die reduzierte Form eine höhere Aktivität aufweist. Um zu verifizieren, ob Trx die Aktivität von Tic55, PTC52 und PAO als Reaktion auf die Licht-Dunkel-Regulation und/oder oxidativen Stress regulieren könnte, verglichen wir die In-Vitro-Import-Kapazitäten der verschiedenen Import-Komplexe in tigrina d12 – Chloroplasten, die aus Pflanzen stammten, die entweder unter kontinuierlichem Weiß-Licht angezogen oder vor der Plastiden-Isolierung verdunkelt bzw. einem Dunkel-Licht-Shift unterworfen worden waren. Tic55, PTC52 und PAO reagierten sensitiv gegenüber einer oxidativen Kontrolle und waren in wiederbelichteten tigrina d12 – Pflanzen inaktiv. In CAO ist kein CxxC-Motiv vorhanden, so dass CAO weder auf das Thioredoxin-System noch auf oxidativen Stress reagiert.

Abstract in weiterer Sprache

Higher plants contain a superfamily of non-heme oxygenases sharing the same conserved Rieske and mononuclear iron binding domains. Members of this family comprise Tic55, PAO, CAO, CMO, and a 52-kDa protein (PTC52) associated with the precursor NADPH:protochlorophyllide (Pchlide) oxidoreductase A (pPORA) translocon. The expression of the AtCAO cDNA in Synechocystis, which does not contain a CAO gene, gave rise to Chlorophyll b (Chl b) and to low levels of Pchlide b. Pulse labeling experiments using the isolated PTC complex and the Pchlide precursor 5-amino-levulinic acid (5-ALA) have shown that PTC52 operates as Pchlide a oxygenase. The coupled in vitro transcription/translation of Arabidopsis CAO (AtCAO) and PTC52 (AtPTC52) cDNAs led to the production of catalytically active proteins with CAO converting Chlide a to Chlide b. In contrast, PTC52 catalyzed Pchlide a to Pchlide b conversion. In barley and Arabidopsis cotyledons, the import of pPORA requires Pchlide. During membrane passage, pPORA interacts with the components of the PTC complex and establishes junction complexes between the outer and inner plastid-envelope membranes. CAO, which is synthesized as a larger precursor, is imported into the intermembrane space via the general protein import machinery. After processing, we showed CAO to be an intrinsic protein of the thylakoid membranes and the plastid inner envelope interacting with Tic40, Tic22 and Tic20 and establishing a novel Tic subcomplex. Further experiments with chloroplasts of the Chlorina mutant ch1-3 (no functional CAO gene; fails to accumulate Chl b und LHC proteins) revealed no import of pLhcb1 (the precursor to the LHCII apoprotein) and pLhcb4 (the precursor to the CP29 apoprotein). PTC52 is synthesized as a larger, ≈57-kDa precursor which is imported into chloroplasts and processed to mature size. We showed the mature 52-kDa protein to be an intrinsic membrane protein of the inner plastid envelope interacting with PTC130, PTC90, PTC16/Oep16 and PTC33/Toc33, forming a functional protein import complex (PTC complex). During the substrate-dependent import pathway of pPORA, PTC52 catalyzes the oxygenation of Pchlide a to Pchlide b. DEPC operates by ethoxyformylating the conserved His residues of the Rieske iron-sulfur cluster. At low DEPC concentrations only the import of pPORA was inhibited, whereas in the presence of 1 mM DEPC no pPORA import occurred, and translocation of Tic55 import substrates was reduced by approximately 10 %. This result proved the involvement of His residues in the catalytic mechanism of PTC52 and part of the PTC complex. With two PTC52-knockout-lines (SALK_011945 and SAIL_148.HC5) we demonstrated that loss-of-function mutations in the Arabidopsis PTC52 gene gave rise to an embryo-lethal phenotype so that heterozygous AtPTC52/Atptc52 plants were utilized to gain insights into the role of PTC52 in planta. These seedlings were more sensitive to illumination, an observation that could be explained by lower amounts of “light-harvesting” POR-Pchlide (LHPP) complexes in the prolamellar bodies of etioplasts. Pigment analysis identified both Pchlide a and Pchlide b in wild-type seedlings and unveiled a change in their relative proportions towards Pchlide a in AtPTC52/Atptc52 seedlings. These changes correlated with decreases in normal Chl accumulation, an altered Chl b-to-Chl a ratio and a reduction of LHCII levels during the early hours of greening. Using affinity purification procedures we identified Tic55, PTC52 and PAO as thioredoxin (Trx)-targets in the inner plastid envelope membrane of chloroplasts. Aside from the presence of conserved Rieske- and [2Fe-2S]-clusters these proteins share a CxxC motif. Activity measurements performed in the presence or absence of stromal Trx f and Trx m suggested that PTC52 and PAO of barley may undergo reversible oxidation/reduction reactions involving redox-active protein SH-groups, the reduced form being more active. To test whether Trx could regulate the activity of Tic55, PTC52 and PAO in response to light-dark regulation and/or oxidative stress we compared the in vitro import capability of the different import complexes in tigrina d12 chloroplasts isolated from light grown plants and from plants that had been shifted to a dark period or a nonpermissive dark to light shift before plastid isolation. We found that Tic55, PTC52, and PAO were sensitive to oxidative control and were inactivated in reilluminated tigrina d12 plants. No CxxC motif is present in CAO, which does not respond to either the thioredoxin system or oxidative stress.