Molecular Characterization of Sugarcane Yellow Leaf Virus (SCYLV) and its Effect on Sucrose Transporters in Sugarcane Saccharum spp. hybrids

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ElSayed, Abdelaleim Ismail Ibrahim:
Molecular Characterization of Sugarcane Yellow Leaf Virus (SCYLV) and its Effect on Sucrose Transporters in Sugarcane Saccharum spp. hybrids.
Bayreuth , 2010
( Dissertation, 2010 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Sugarcane is an important crop plant and has served as a source of sugar for hundreds of years, recently it is used to produce bioethanol, a renewable bio-fuel energy source. Sugarcane yellow leaf virus (SCYLV) was detected in the late 1990s first in Hawaii as a causal agent of a sugarcane disease which leads to sugarcane yellow leaf syndrome and reduced sugar yield. The presence of Sugarcane yellow leaf virus was determined by RT-PCR in several sugarcane cultivars, mostly from Hawaii. Interesting was the comparison of so-called susceptible versus resistant cultivars. As expected, the susceptible Hawaiian cultivars H73-6110 and H87-4094 showed strong PCR amplification products of SCYLV, while the virus-free line H87-4094, produced by tissue culture, showed no PCR product. The three resistant cultivars H87-4319, H78-4153 and H78-7750 showed quite different amplification patterns. While H78-4153 and H78-7750 expressed a weak but specific band of the correct size, unexpectedly H87-4319 showed strong amplification product. Three Cuban cultivars (C1051-73, JA-605 and CP52-43) showed low titer of SCYLV. No PCR amplificate was obtained with the moderately susceptible cultivar H65-7052. Aphids feeding on cv. H87-4094 contained sufficient virus to yield a SCYLV-signal similar in strength as from preparations from resistant cultivars. Northern blot analysis supported the results obtained from RT-PCR. The presence of SCYLV in the cultivars with low amount of virus titer (H87-4319, H78-7750 and H78-4153) indicated that they should better be called tolerant for the virus in the sense that they allow a low replication rate for SCYLV. Virus preparations from 3 Hawaiian cultivars (two susceptible and one resistant) were fully sequenced. Quantitative analysis for four different genome regions of SCYLV covering the 6 ORFs has been performed for these 3 cultivars using the GeXP analysis system. The transcript levels of the different regions of SCYLV in these cultivars were present at very different quantities, for example ORF0-1 transcripts were up to 10 times more frequent than transcripts of ORF3-4. The SCYLV-sequences from the 3 Hawaiian cultivars were aligned to published full and partial sequences. The phylograms corroborated previous findings that the so-called YLS-segment coding for the coat protein shows the least genetic diversity, whereas the other sequence fragments A-D, representing the ORFs 0-5, expressed a twofold higher diversity. The phylograms of partial sequences and of the whole genome placed the Hawaiian SCYLV-strains next to the Peru strain, apart from the BRA-strains and well apart from the REU-strains. It is proposed that the Hawaiian SCYLV is considered as own group together with the Peru strain as HAW-PER. The sequences from the two susceptible cultivars had a deletion of 48 to 54 nt in ORF1, which codes for the gene silencing suppressor/RNA-dependent RNA-polymerase complex. It is speculated that this deletion is important for the proliferation rate of the virus in the plant. Sucrose is the main product of sugarcane, which accumulates in the stalk internodes in excess of 50 % of the dry weight. To gain an overview of the physiological status of SCYLV-infected sugarcane compared to virus-free plants, gene expression. Sucrose increased rapidly between internodes 3 and 7, reaching a maximum in internodes 7. Sugars content in leaves, seedling and internodes were increased as effect of the SCYLV-infection. Sucrose phosphate synthase (SPSII) transcript levels were approximately the same in sink, source and internodes with a trend to be higher in the mature internodes. A sucrose transporter of Hawaiian cultivar was isolated and sequenced and classified as ShSUT1A. There is high variability among the SUT1 subfamily with identities of 70-97%. The identity between ShSUT1A and ShSUT1 was 97.4%. It is expressed in sink, source and storage tissues. The ShSUT1A was expressed at approximately similar extent in SCYLV-infected and virus-free sugarcane. In addition a partial sequence of a sucrose transporter belonging to the SUT4 family was first obtained in sugarcane and its transcript levels in plant organs were measured. Quantitative analysis for sucrose transporters (ShSUT1 and ShSUT4) using the GeXP analysis system showed that sucrose transporter ShSUT1 was at a higher transcript expression than ShSUT4 in sink and source leaves, but not in mature internodes. In conclusion, - SCYLV from Hawaiian cultivars was characterized as belonging to an own subgroup (HAW- PER), - A deletion of 48-54 nt was detected in the SCYLV-sequence from susceptible cultivars, which may be correlated to virus proliferation, and - large differences in transcript levels of the viral ORFs were found. - Sucrose transporter transcripts and SPSII transcripts were not strictly correlated to SCYLV- infection and do not explain the pathological effect of SCYLV on sugarcane.

Abstract in weiterer Sprache

Zuckerrohr ist eine wichtige Weltwirtschaftspflanze, die seit Jahrhunderten als Zuckerquelle und neuerdings als nachwachsende Energiequelle z. B. für Bio-Ethanol dient. In den 1990ern wurde Zuckerrohr-Gelbblatt-Virus als Ursache für die Gelbblatterkrankung von Zuckerrohr und der daraus erfolgten Ernteminderung entdeckt. SCYLV wurde mittels RT-PCR in mehreren Zuckerrohrkultivaren, die meisten davon aus Hawaii, nachgewiesen. Interessant war der Vergleich von sogenannten suszeptiblen und resistenten Kultivaren. Erwartungsgemäß ergaben die suszeptiblen Kultivare H73-6110 und H87-4094 mächtige PCR-Banden für SCYLV, während die virusfreie Linie von H87-4094, die aus Gewebekultur gewonnen worden war, kein Amplifikat zeigte. Die 3 resistenten Kultivare zeigten unterschiedliche Ergebnisse. Während H78-4153 und H78-7750 nur schwache Banden erzeugten, wurde bei H87-4319 unerwarteterweise eine starke Amplifikation beobachtet. Drei cubanische Kultivare (C1051-73, JA-605, CP52-43) zeigten einen niedrigen SCYLV-Titer. Das gemäßigt suszeptible Kultivar H65-7052 erbrachte kein SCYLV-Amplifikat. Aphiden, die von infiziertem H87-4094 entnommen wurden, ergaben ein Amplifikat in ähnlicher Stärke wie die resistenten Zuckerrohrkultivare. Ergebnisse von Northern Blots unterstützten die Befunde aus RT-PCR. Wegen der Tatsache, dass die resistenten Kultivare SCYLV, wenn auch in niedrigem Titer, enthielten, sollten sie besser als virus-tolerant bezeichnet werden. Viruspräparationen aus 3 hawaiianischen Kultivaren (2 suszeptible und 1 resistentes) wurden sequenziert. Die Menge viraler Transkripte von 4 Fragmenten, die die 6 ORFs abdeckten, wurde mittels GEXP in den 3 Kultivaren bestimmt. Die Transkripte dieser SCYLV-Abschnitte waren zu sehr unterschiedlichem Ausmaß vorhanden, beispielsweise war das Fragment zu ORF0-1 bis zu 10fach mehr vorhanden als das Fragment zu ORF3-4. Die SCYLV-Sequenzen der 3 hawaiianischen Kultivare wurden mit publizierten Sequenzen verglichen und phylogenetisch analysiert. Das sogenannte YLS-Segment zeigte sich als das konservierteste, während die anderen Segmente eine doppelt so hohe Diversität zeigten. Das Phylogram platzierte den hawaiianischen SCYLV-Stamm zusammen mit einem Stamm aus Peru als separate Gruppe, genannt HAW-PER, abgetrennt von BRA-Stämmen und REU-Stämmen. Die viralen Sequenzen aus den beiden suszeptiblen Kultivaren hatten eine 48-54 nt lange Deletion in ORF1, welcher für ein gene silencing/RNA-abhängige RNA-Polymerase-Komplex codiert. Es wird spekuliert. Saccharose ist das hauptsächliche Speicherprodukt von Zuckerrohr und kann im Stamm über 50% des Trockengewichts ausmachen. Um den physiologischen Status der SCYLV-infizierten versus virusfreien Pflanze zu erkunden wurden Zuckergehalt und Transkriptmenge für Saccharosetransporter, Saccharose-Phosphat-Synthase II (SPSII) und die viralen Segmente gemessen. Der Saccharosegehalt nahm von Internodium 3 zu 7 stark zu. SCYLV-Infektion erhöhte den Zuckergehalt leicht in Blättern und Internodien. Die Transkriptmengen von SPSII waren etwa gleich hoch in infizierten und virusfreien Pflanzen, mit einer leichten Erhöhung in reifen Internodien. Ein Saccharosetransporter wurde aus einem hawaiianischem Kultivar isoliert und als ShSUT1A klassifiziert. Die Variabilität zwischen den SUT1-Mitgliedern liegt bei 70-97% Identität, ShSUT1 und ShSUT1A sind zu 97,4% identisch. ShSUT1 ist in sink, source und Internodien exprimiert und findet sich etwa gleich stark in infizierten und virusfreien Pflanzen. Ferner wurde eine Teilsequenz eines weiteren Saccharosetransporters in Zuckerrohr entdeckt, welcher zur SUT4-Gruppe gehört. Die quantitative Transkriptanalyse mittels GEXP zeigte dass ShSUT1 in sink und source Blättern deutlich stärker exprimiert ist als ShSUT4, nicht aber so in reifen Internodien. Die Ergebnisse können so zusammen gefasst werden: - SCYLV aus hawaiianischen Zuckerrohrkultivaren gehört zu einer eigenen Gruppe (HAW- PER), - suszeptible Kultivare enthalten SCYLV mit einer 48-54 nt Deletion, welche mit der Virusvermehrung in Zusammenhang stehen könnte, und - es gibt große Unterschiede in der Transkription der viralen Genomteile. - Saccharosetransporter-Transkripte und SPSII-Transkripte waren nicht deutlich unterschieden zwischen infizierten und virusfreien Pflanzen und können deshalb nicht als kausale Erklärung der SCYLV-Symptome dienen.