New Microtubule-destabilizing Agents : Optimization of their Anti-angiogenic, Vascular-disruptive, and Anti-metastatic Activity

Titelangaben

Schmitt, Florian:
New Microtubule-destabilizing Agents : Optimization of their Anti-angiogenic, Vascular-disruptive, and Anti-metastatic Activity.
Bayreuth , 2018 . - V, 189 S.
( Dissertation, 2018 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Für den Wachstum, die Progression und Metastasierung eines Primärtumors ist die Ausbildung eines intratumoralen Blutgefäßsystems essentiell. Aus diesem Grund stellt die Tumorvaskulatur ein attraktives Ziel (Target) bei der Chemotherapie dar. Während anti-angiogene Agenzien ihre Wirkung durch Hemmung der Blutgefäßausbildung erzielen, agieren vaskular-disruptive Wirkstoffe, indem sie bereits bestehende Blutgefäße im Tumor zerstören. Mikrotubuli-destabilisierende Agenzien, wie sie im Rahmen der vorliegenden Arbeit getestet wurden, sind dafür bekannt auf beiden Wegen Einfluss auf die Tumorvaskulatur nehmen zu können. Durch die Deregulierung der Mikrotubulidynamik werden zahlreiche Signalwege sowie der intrazelluläre Transport verändert, wodurch Migration und Angiogenese beeinflusst werden. Besonders sensibel reagieren Endothelzellen innerhalb der Tumorvaskulatur auf die Behandlung mit Mikrotubuli-destabilisierenden Agenzien. Durch die Zerstörung des Zytoskeletts dieser Zellen wird die ohnehin schon instabile und ungewöhnlich permeable Tumorvaskulatur weiter destabilisiert. In Folge kommt es zur Zerstörung der Blutgefäße, wodurch Tumornekrose ausgelöst wird. Durch geschickte Modifizierung bekannter Mikrotubuli-destabilisierender Agenzien sollten die Schwachstellen dieser Verbindungsklasse, wie deren geringe therapeutische Breite und deren Anfälligkeit für Multiresistenzen, behoben werden. Gleichzeitig galt es aber deren anti-vaskulare und anti-metastatische Aktivität zu optimieren. Ziel dieser Arbeit war es unter Verwendung diverser in vitro und in vivo Testsysteme Testverbindungen und deren Wirkmechanismen zu evaluieren, um geeignete Wirkstoffkandidaten zu finden, die diese Kriterien erfüllen. Zunächst wurde im Rahmen der präklinischen Untersuchungen der Referenzverbindungen sowie von deren Derivaten, deren zytotoxische und anti-proliferative Aktivität in kultivierten Krebszelllinien diverser Entitäten bestimmt. Überdies wurden die Auswirkungen der neuen Verbindungen auf etliche zelluläre Komponenten, Vorgänge und Signalwege biochemisch/zellbiologisch evaluiert. Die anti-migrative und anti-angiogene Aktivität ausgewählter Verbindungen wurde in vitro mittels diverser Assaysysteme an verschiedenen Zelltypen getestet. In vivo wurde die vaskular-disruptive Aktivität bestimmter Derivate auf die sich entwickelnden Blutgefäßen der Chorioallatoismembran in Hühnereiern untersucht während die anti-angiogene Aktivität anhand der Entwicklung der subintestinalen Venen im Zebrafischembryo bestimmt wurde. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden für eine Serie von Chalkon- und strukturverwandten Pyrazolinderivaten anti-proliferative Effekte sowie Veränderungen der Tubulindynamik belegt. Neben der Induktion von Apoptose lösen die Derivate Veränderungen des Aktinzytoskeletts aus, wodurch die Migrierfähigkeit der Zellen herabgesetzt wird. Hinzu kommt, dass die getesteten Derivate die Fähigkeit besitzen über die Inhibition von ABC Efflux-Transportern Wirkstoffresistenzmechanismen von Krebszellen zu umgehen. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Optimierung der Wirkung des stark anti-proliferativen Naphthopyrans LY290181. Die Wirkung von Derivaten von LY290181 hängt dabei stark von deren Substitutionsmuster ab. Neben der vermehrten Destabilisierung der Mikrotubuli, initiieren die Naphthopyranderivate eine verstärkte Ausbildung von Aktin Stress Fibres. Daraus resultieren die Verringerung der Migrierfähigkeit von Tumorzellen und die anti-angiogene Wirkung dieser Verbindungen. Erstmalig konnten für Derivate dieser Verbindungsklasse vaskular-disruptive Effekte auch in vivo nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu vielen weiteren Mikrotubuli-destabilisierenden Agenzien konnte ein Analogon von LY290181 gefunden werden, das durch eine gute therapeutische Breite besticht, so dass das Tumorwachstum in Xenograft-Mäusen gehemmt wurde. Indem Naphthopyrane als Liganden an (Aren)Ruthenium(II)-Fragmente koordiniert wurden, konnten additive Effekte aus der Wirkung des Naphthopyrans und der des Rutheniumfragments erzielt werden. So wurde neben den Veränderungen der Zytoskelettkomponenten auch DNA Bindung festgestellt. Die anti-angiogene Aktivität der Verbindungen, die sowohl als Eigenschaft von Rutheniumkomplexen als auch von Mikrotubuli-destabilisierenden Agenzien bekannt ist, konnte in vivo im Zebrafischembryo belegt werden. Der dritte Teil dieser Arbeit behandelt eine Serie von Verbindungen, die vom Mikrotubuli-destabilisierenden Naturstoff Combretastatin A-4 abgeleitet ist. Neben der chemischen Stabilisierung von dessen bioaktiver cis-Form wurden die neuen Verbindungen mit Alkylhydroxamsäureresten unterschiedlicher Länge versehen. Dadurch sollten die Derivate neben der Combretastatin A-4 vermittelten Hemmung der Mikrotubuli-Dynamik noch als Histondeacetylaseinhibitoren fungieren. Für die anti-proliferative Wirkung dieser hochselektiv an Krebszellen wirkenden Hybridverbindungen ist die Hydroxamsäurefunktion essentiell. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Länge des Verbindungsstücks (Linker) zwischen dem Combretastatin A-4 Grundgerüst und der Hydroxamsäure die Wirkung der Verbindungen stark beeinflusst. Tendenziell steigen die anti-proliferative sowie die Mikrotubuli-destabilisierende Wirkung je kürzer der Linker gewählt wird. Im Gegensatz dazu inhibieren die Verbindungen Histondeacetylasen umso besser je länger deren Linkerfunktion ist. Während die kurzkettigen Derivate mit starkem Einfluss auf die Mikrotubuli zur Arretierung des Zellzyklus in der G2/M Phase führen, induziert der beste Histondeacetylaseninhibitor mit dem längsten Linker zu einem Arrest in der G1 Phase. Unabhängig von der Linkerlänge führen die Combretastatin A-4 Derivate zu Veränderungen des Aktinzytoskeletts. Die vermehrte Ausbildung von Aktin Stress Fibres führt dazu, dass die Migrierfähigkeit der behandelten Zellen herabgesetzt wird.

Abstract in weiterer Sprache

The development of an intratumoral vasculature is essential for tumor growth, progression and metastasis. Hence, tumor vasculature represents an attractive target for chemotherapy. While anti-angiogenic agents exert their effect by inhibition of blood vessel development, vascular-disruptive compounds act by the destruction of already established tumor vasculature. Microtubule-destabilizing agents such as the ones discussed in this thesis are known to influence tumor vasculature in both ways. By deregulation of microtubule dynamics various signaling pathways and the intracellular transport are altered which effects migration and angiogenesis. Especially, the endothelial cells within the tumor vasculature are sensitive towards the treatment with microtubule destabilizing agents. By alterations of their cytoskeletal organization, the already fragile and abnormally permeable tumor vasculature is further destabilized. Hence, the tumor vasculature is disrupted causing necrosis of the tumor. By subtly modifying the chemical structures of known microtubule-destabilizing agents the shortcomings of this class of compounds such as their small therapeutic window and their susceptibility towards multi-drug resistance were to be remedied. In unison, their anti-vascular and anti-metastasis activity were to be optimized. The aim of this work was to evaluate compounds and their mode of action by using various in vitro and in vivo assays in order to identify potential new drug candidates. Reference compounds and their derivatives were evaluated in preclinical studies for their cytotoxic and anti-proliferative activity in cultivated cancer cell lines of various entities. Moreover, the effect of the new compounds on diverse cellular components, processes and signaling pathways was investigated by biochemical and immunological methods. The anti-migratory and anti-angiogenic activity of the best compounds were determined by using in vitro assay systems. While the vascular disrupting activity of these compounds was evaluated by monitoring their effect on the developing blood vessels of the avian chorioallantois membrane, their anti-angiogenic activity was determined by analysis of the subintestinal veins in zebrafish embryos. First the anti-proliferative effects and alterations of tubulin dynamics were proved for a series of chalcones and related pyrazolines. These derivatives induce apoptosis and alter the actin cytoskeleton causing reduced migration. Moreover, the investigated derivatives are able to circumvent multidrug resistance by inhibition of ABC efflux transports. The second part of this work is dealing with the optimization of the effects of the strongly anti-proliferative naphthopyran LY290181. The effects of new derivatives of LY290181 strongly depend on their substitution pattern. Beside the augmented destabilization of microtubules the new compounds initiate a pronounced formation of actin stress fibres causing reduced migration of tumor cells and anti-angiogenic effects. These studies proved the vascular-disruptive activity in vivo for the first time for this specific class of compounds. The best analogue of LY290181 convinced with its excellent therapeutic window and by inhibition of tumor growth in mice bearing xenograft tumors. For a second generation of (arene)ruthenium(II) complexes bearing naphthopyrans, additive effects of naphthopyran and ruthenium fragment properties were observed. Beside the alterations of cytoskeletal components, DNA binding was proven. The anti-angiogenic activity of these compounds, typical of both ruthenium complexes and microtubule-destabilizing agents, were confirmed in vivo in zebrafish embryos. The third part of this work deals with a series of compounds which are derived from the known microtubule-destabilizing natural compound combretastatin A-4. The bioactive cis-configuration of combretastatin A-4 was chemically stabilized in these new compounds. By adding tethered hydroxamic acids of different length to the derivatives, the resulting compounds were supposed to combine the combretastatin A-4 mediated inhibition of microtubule dynamics with the inhibition of histone deacetylases. The hydroxamic acid is crucial for the anti-proliferative activity of these hybrid compounds which showed a distinct selectivity for cancer cells over non-malignant fibroblasts. In addition, it was found that the activity of the test compounds strongly depends on the length of the linker between the combretastatin A-4 backbone and the hydroxamic acid. While the anti-proliferative and microtubule-destabilizing activities grow with decreasing linker length, the compounds inhibit histone deacetylases more effectively the shorter their linker is. Those compounds bearing short linkers and having the highest effect on microtubule dynamics induce the arrest of the cell cycle progression at G2/M. On contrary, the most potent histone deacetylase inhibitor with the longest linker caused the accumulation of cells at the G1 phase. However, alterations of the actin cytoskeleton are independent of the linker length. The enhanced formation of actin stress fibres indicates a reduced migration of treated cells.