Analyse intrazellulärer Fluide mittels orts- und zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie

Titelangaben

Veres, Andreas:
Analyse intrazellulärer Fluide mittels orts- und zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie.
2018 . - 209 S.
( Dissertation, 2018 , Universität Bayreuth, Fakultät für Mathematik, Physik und Informatik)

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Abstract

Die quantitative Biophysik konnte in den vergangenen Jahren viele bedeutende Fortschritte erzielen. Unter Zuhilfenahme verschiedener Fluoreszenzspektroskopietechniken gelang es, neue Einsichten in die Selbstorganisation des Zellinneren und die Dynamik zellulärer Proteine zu gewinnen. Für die pharmakologische, medizinische und biophysikalische Forschung ist neben der Proteindynamik auch das Verständnis zellulärer Mechanismen und Reaktionen auf externen Stress von höchster Bedeutung. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der räumlich aufgelösten Stressantwort zellulärer Fluide. Intrazellulärer Stress wird über die räumlich spezifische Antwort nanoskopischer Sensoren in lebenden Zellen quantifiziert. Hierbei wird ausgenutzt, dass diese molekularen Sensoren durch die Wechselwirkung mit ihrer Mikroumgebung photophysikalische Veränderungen zeigen. Diese Stressantwort verschiedener Zelllinien, hervorgerufen durch chemotherapeutische, oxidative und hyperosmotische Behandlung, kann demnach mit Hilfe von Lebenszeit- und Intensitätsmessungen der Fluoreszenz bestimmt werden. Die kompartimentspezifische Untersuchung von HeLa (humane Zervixkarzinom)-Zellen mit Hilfe des molekularen Rotors DASPMI zeigt sowohl im chemotherapeutischen als auch im oxidativen Stresszustand, hervorgerufen durch Cisplatin und Wasserstoffperoxid, einen deutlichen Rückgang der mitochondrialen Viskosität. Zusätzlich zu diesen Untersuchungen wird ein schneller Segmentierungsalgorithmus für die Zuweisung zellulärer Kompartimente im Phasorraum vorgeschlagen. Diese Methode nutzt die Funktionalität molekularer Rotoren, ihre Lebenszeitfraktionen abhängig von ihrer Mikroumgebung zu verändern während sie zur selben Zeit größtenteils von der Fluoreszenzlöschung unbeeinflusst bleiben. Mit Hilfe von CellRox-DeepRed, einem durch Oxidation aktivierten molekularen Sensor, lässt sich in HPV (humanes Papillomavirus)-positiven HeLa-Zellen ein Rückgang von Antioxidantien nach der Behandlung mit Menadion und der damit einhergehenden Hemmung der Glutathion-Peroxidase nachweisen. In diesem Projektabschnitt wird die Sensitivität verschiedener Auswertemethoden geprüft um geringe Unterschiede in Lebenszeitmessungen zu detektieren. Über die FRET-Effizienz des molekularen Klappsensors FCrH2 lassen sich Informationen über den Gedrängtheitszustand zellulärer Fluide unter verschiedenen osmotischen Bedingungen gewinnen. Dieser Sensor wird sowohl in der nukleoplasmischen als auch zytoplasmischen Region exprimiert und ist in der Lage, räumlich aufgelöst Aussagen über die Gedrängtheit der betreffenden Fluide zu treffen. Es zeigt sich, dass FCrH2 für die Unterscheidung verschiedener osmotischer Bedingungen in lebenden Zellen sehr gut geeignet ist und osmolaritätsunabhängig intrazelluläre Unterschiede, wenn auch gering signifikant, mit seiner Hilfe aufgedeckt werden können. Um räumlich-zeitliche Korrelationen in zellulären Fluiden quantifizieren zu können und dem Lehrstuhl eine neue Mikroskopietechnik zur Verfügung zu stellen, wird ein optischer Aufbau entwickelt, beschrieben und mittels geometrischer und Fourieroptik charakterisiert. Das Setup ermöglicht mittels Verwendung der invertierten Lichtblattmikroskopie schnelle Fluoreszenzbildgebung mit freier Messbereichswahl.

Abstract in weiterer Sprache

Over the past years major progress has been made in the field of quantitative biophysics regarding the self-organization of the cellular interior and protein dynamics by a multitude of fluorescence measurement techniques. Beyond mere dynamics, understanding cellular mechanisms and responses to external stress is of great importance for pharmaceutical and medical, as well as biophysical research. This thesis focuses on the spatially resolved stress-response of cellular fluids. Methods to quantify cellular stress are based on the locus-specific feedback given by nanoscopic molecular sensors inside living cells. These stress-translating molecules are known to change their photophysical properties through interaction with their micro-environment. The photophysical response to chemotherapeutical, oxidative and hyperosmotic stress induced by various stress-agents in different cell lines before and after drug treatment are analyzed by fluorescence lifetime and intensity measurements. Exploring the compartment-specific response of HeLa (human cervical carcinoma) cells to chemotherapeutical and oxidative stress with the help of the molecular rotor DASPMI reveals a significant decrease of mitochondrial viscosity after treatment with cisplatin as well as hydrogen peroxide. Additionaly, a rapid and novel segmentation algorithm separating cellular compartments in phasor space is proposed. This phasor segmentation technique is based on the functionality of molecular rotors that shift their fluorescence lifetime contributions with respect to their surrounding and furthermore demonstrate negligible affinity to fluorescence quenching effects. CellRox-DeepRed, a sensor photoactivated by reactive oxygen species, reveals a decline of antioxidants in HPV (human papilloma virus)-positive HeLa-cells after the menadione-induced suppression of glutathione synthesis. In this context, several evaluation techniques are investigated, focussing on their reliability to distinguish small measurement differences in fluorescence lifetime data sets. Intracellular crowding measurements elucidate the ability of a crowding-sensor, FCrH2, to differentiate cellular fluids under different osmotic conditions. The folding and unfolding dynamics of this FRET-sensor, expressed in the nucleoplasmic and cytoplasmic region of HeLa-cells, provides information on the crowding-state of their surrounding. In this project the excellent sensitivity to hyperosmotic stress as well as the much lower but still measurable locus specifity of this molecular sensor is presented. In the scope of enabling spatiotemporal correlation measurements, a custom made microscope is described and characterized by means of geometrical as well as Fourier optics. The presented spectroscopic setup enables fast and scalable wide-field fluorescence applications utilizing the technique of inverted light-sheet microscopy.