Von der Faltung zur Funktion: Steuerung des Infektionsmechanismus filamentöser Phagen durch Faltungsprozesse und Beschleunigung oxidativer Faltung durch Thioloxidasen

Titelangaben

Lorenz, Stefan:
Von der Faltung zur Funktion: Steuerung des Infektionsmechanismus filamentöser Phagen durch Faltungsprozesse und Beschleunigung oxidativer Faltung durch Thioloxidasen.
Bayreuth , 2010
( Dissertation, 2010 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die filamentösen Phagen IF1 und fd sind eng miteinander verwandt. Dies spiegelt sich auch bei der Infektion von E. coli Zellen wider, die bei beiden Phagen nach einem Zweischrittmechanismus abläuft, der durch die jeweiligen Gen-3-Proteine (G3P) vermittelt wird. Im ersten Schritt bindet die N2 Domäne von G3P an den bakteriellen Pilus, beim Phagen IF1 an den I Pilus, beim Phagen fd an den F Pilus. Durch die spezifische Bindung an einen Pilus bestimmt die N2 Domäne von G3P die Wirtsspezifität des Phagen. Im zweiten Schritt der Infektion interagiert in beiden Fällen die N1 Domäne mit dem bakteriellen Rezeptor TolA-C. Die N1 Domänen der G3Ps beider Phagen binden mit demselben Bindungsmuster an die gleiche Stelle von TolA C, wie die Röntgenstrukturanalyse der beiden Komplexe zeigt. Der molekulare Mechanismus der Infektion unterscheidet sich, da die G3Ps der Phagen IF1 und fd eine verschiedenartige Domänenorganisation besitzen. Im G3P des Phagen IF1 stellen N1 und N2 zwei eigenständige und stabile Einheiten dar, die Bindungsstellen für den I Pilus und TolA-C sind daher permanent zugänglich. Das native G3P des Phagen fd liegt dagegen in einer geschlossenen, inaktiven Konformation vor, in der N1 und N2 fest miteinander assoziiert sind und die Bindungsfläche für TolA-C auf N1 in der Grenzfläche zwischen N1 und N2 verborgen ist. Erst die Bindung von N2 an den bakteriellen F Pilus führt zur Domänendissoziation, wodurch die Bindungsstelle für TolA C auf N1 zugänglich wird. Dieser komplexe Infektionsmechanismus des Phagen fd konnte in den einfacheren Infektionsmechanismus des Phagen IF1 überführt werden, indem die Domäneninteraktion durch die Deletion von sieben Aminosäuren im Gelenkbereich zwischen N1 und N2 aufgelöst wurde. Eine Erhöhung der Infektionsraten auf das Niveau des Referenzphagen fd wurde durch eine nachträgliche selektive Stabilisierung der N2 Domäne erreicht. Die Phagen fd und IF1 entwickelten unterschiedliche Strategien um Infektiosität und eine hohe thermodynamische Stabilität der G3Ps zu vereinen. In IF1 G3P bildeten sich zwei eigenständige, stabile Domänen aus, in fd G3P hingegen etablierte sich eine geschlossene Konformation, in der die labile N2 Domäne durch eine starke Assoziation mit der N1 Domäne stabilisiert wird. Die Notwendigkeit der Domänendissoziation in G3P während der Infektion durch den Phagen fd wurde durch die Konstruktion eines G3Ps nachgewiesen, in dem N1 und N2 durch eine Disulfidbrücke kovalent miteinander verknüpft sind. Diese Verknüpfung verhindert die Domänendissoziation und folglich die Infektion. Das Phagenkonstrukt mit dieser G3P Variante als Vermittler der Infektion ermöglicht eine steuerbare Infektion, die durch Reduktion der Disulfidbrücke induziert werden kann. Die Konstruktion von Disulfidbrücken wurde ebenfalls benutzt, um die Chaperondomäne der Peptidyl-Prolylisomerase SlpA zu stabilisieren. In weitergehenden Untersuchungen werden die Disulfidbrücken in das Volllängenprotein SlpA eingebaut, um die Auswirkung dieser entropischen Stabilisierung auf Funktion und Stabilität des Zweidomänenproteins analysieren zu können. Die Chaperondomäne der Peptidyl-Prolylisomerase SlyD, die in isolierter Form ungefaltet vorliegt, konnte ebenfalls durch den Einbau einer Disulfidbrücke stabilisiert werden. Die konformationelle Faltung dieser stabilisierten Variante ist strikt an die Ausbildung der Disulfidbrücke gekoppelt. Daher eignet sich dieses Protein hervorragend als Substrat, um die Beschleunigung der oxidativen Faltung durch Thioloxidasen zu charakterisieren. Die Effizienz der Katalyse der oxidativen Faltung korreliert dabei nicht mit dem Reduktionspotential der Faltungshelfer, sondern mit der Fähigkeit nicht-native Substratproteine über hydrophobe Bindungsflächen, hier Chaperondomänen, zu binden. Die Bindung nicht-nativer Substrate über Chaperondomänen, sowie ein geeignetes Reduktionspotential des katalytischen Disulfids, sind ebenfalls Voraussetzungen für eine Disulfidisomeraseaktivität von Faltungshelfern. Deshalb besitzen PDI und DsbC neben einer hohen Thioloxidaseaktivität auch eine hohe Disulfidisomeraseaktivität. Für diese Untersuchungen wurde ein sensitiver Test auf Grundlage der Reaktivierung fehlgefalteter RNase T1 und der Hydrolyse von Fluorophor-markierten Oligonukleotiden etabliert und zur Analyse von PDI, DsbC und DsbA eingesetzt. Mia40 ist eine neuartige Thioloxidase im Intermembranraum von Mitochondrien. Für Mia40 konnte die Kristallstruktur mit einer Auflösung von 2,3 Å gelöst werden. Mia40 zeigt keine strukturelle Ähnlichkeit zu bekannten Thioloxidasen. Wie viele andere Faltungshelfer wirkt Mia40 als Chaperon, in vitro verhindert es effektiv die Aggregation rückfaltender Citratsynthase. Mia40 zeigt in vitro lediglich Oxidase-, aber keine Disulfidisomeraseaktivität. Ob Mia40 in vivo ausschließlich als Thioloxidase wirkt, oder bei speziellen Substraten doch fehlerhafte Disulfidbrücken auflösen kann, ist noch unklar und Gegenstand weiterführender Forschungsarbeiten.

Abstract in weiterer Sprache

The close relationship between the filamentous phages fd and IF1 is reflected in the infection mechanism. Both phages infect E. coli cells by using their gene-3-proteins (G3P) in a two step fashion. First, they establish contacts to the bacterial cell via an interaction of the N2 domain of their G3Ps with the bacterial sex pilus. The N2 domain of G3P determines the host specificity of the phage: phage IF1 infects only E. coli strains bearing I pili, phage fd infects only E. coli strains bearing F pili. In the second step, the N1 domain binds to the C-terminal domain of the periplasmic receptor TolA. The N1 domains of both phages bind in a similar fashion to the same site on TolA-C, which is demonstrated by the crystal structures of both complexes. Although the chronology of the binding steps is the same for both phages, the molecular mechanism of infection differs due to a different domain organization in their G3Ps. In G3P of the phage IF1, N1 and N2 are structurally independent and stable domains that are permanently active for binding. In contrast, G3P of phage fd exists in a closed, inactive state in which the two domains are tightly associated. This ensures a high stability of G3P, but renders the phage incompetent for infection because the binding site for TolA-C is buried at the domain interface. The initial binding of N2 to the F pilus leads to a removal of the domain interactions and exposes the binding site of N1 for TolA-C. This complex infection mechanism could be changed to the simple infection mechanism of phage IF1 by deleting seven residues in the hinge between N1 and N2 and thus eliminating the interdomain interaction in G3P of phage fd. Infection rates as high as those of wildtype phage fd could be attained by improving the conformational stability of the N2 domain. The two phages fd and IF1 used different evolutionary strategies to reconcile infectivity with a high stability of their G3Ps. In the G3P of phage IF1, the two domains N1 and N2 are independent entities and show high thermodynamic stabilities. Phage fd developed a closed form in which the labile N2 domain is stabilized and protected from unfolding by a tight association with the N1 domain. That domain dissociation in G3P of phage fd is in fact a prerequisite for the infection process was demonstrated by connecting N1 and N2 covalently via a disulfide bond. The phage construct with this G3P variant allows a controllable infection, which can be induced by the reduction of the disulfide, thus breaking the covalent linkage between the two domains. A massive stabilization of the isolated chaperone domain of the peptidyl-prolylisomerase SlpA could be achieved by inserting artificial disulfide bonds. In on-going studies, these disulfide bonds will be introduced into the full length protein SlpA to analyze the effects on the function and the thermodynamic stability of this two domain protein. The chaperone domain of the SlpA-homolog SlyD, which is unfolded in isolated form, could also be stabilized by the introduction of a disulfide bond. The stabilization results in a conformational refolding reaction of this protein domain, which is coupled with disulfide bond formation. Therefore this construct could be used to characterize the acceleration of oxidative folding by various thioloxidases. The performance of thiol oxidases as folding helpers does not correlate with their reduction potential. The ability to bind non-native proteins via chaperone domains, together with a suitable reduction potential are also prerequisites for folding helpers to show disulfide isomerase activity. Therefore, PDI and DsbC are not only good thiol oxidases, but also efficient disulfide isomerases. For analyzing disulfide isomerase activity, we established an assay for disulfide isomerase activity, based on the reactivation of scrambled RNase T1. A sensitive probe for RNase activity is provided by the fluorescence change caused by the hydrolysis of a labeled oligonucleotide. Mia40 is a novel thiol oxidase, which is located in the intermembrane space of mitochondria. The crystal structure of Mia40 could be solved to a resolution of 2.3Å. Mia40 shows no structural relationship to other known thiol oxidases. Like many other folding helpers, Mia40 displays also chaperone activity. It inhibits effectively the aggregation of refolding citrate synthase. In vitro, Mia40 solely displays thiol oxidase, but no disulfide isomerase activity. Whether Mia40 functions in vivo simply as thiol oxidase, or whether it is also able to shuffle non-native disulfides in specific substrate proteins remains unclear and is the subject of future studies.