Aerobic Methylotrophic Microorganisms in an Acidic Deciduous Forest Soil: Substrate Range and Effect of pH

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Morawe, Mareen:
Aerobic Methylotrophic Microorganisms in an Acidic Deciduous Forest Soil: Substrate Range and Effect of pH.
Bayreuth , 2018 . - XVIII, 375 S.
( Dissertation, 2017 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Methylotrophic microorganisms possess a unique metabolism that enables them to utilize one-carbon (C1) compounds as a sole source of carbon and energy rendering methylotrophs important sinks of atmosphere-relevant compounds such as methane, methanol and chloromethane. These volatile organic compounds (VOCs) affect the climate and the atmospheric chemistry. Although methylotrophic microorganisms are an object of research since the 19th century, the environmental factors that drive their biodiversity in soils have been hardly resolved. Most soil-derived methylotrophic isolates are neutrophilic and facultatively methylotrophic, which means that they are capable of utilising multi-carbon compounds. Thus, the substrate range as well as the pH might be important ecological niche-defining factors for methylotrophs in a complex microbial community. The current study analysed aerobic methylotrophs in an acidic deciduous forest soil regarding their diversity, their substrate range in terms of utilisation of different C1 compounds and the capability to assimilate multi-carbon compounds, as well as the effect of the pH of soil. Therefore, different incubation experiments mimicking in situ conditions were applied targeting ‘high-affinity’ methanotrophs, methanol-utilisers, and chloromethane-utilisers. Long-term incubations of soil slurries under methanotrophic and mixed substrate conditions focussing on the methane degradation potential of the forest soil, the abundance of ‘high-affinity’ USCα (upland soil cluster α) methanotrophs (based on qPCR analyses targeting the pmoA gene of USCα) and their substrate range revealed a very restricted substrate range comprising apparently solely methane. Therefore, the assumption that ‘high-affinity’ methanotrophs such as USCα might utilise alternative substrates besides methane could not be verified. Insights into the metabolic behaviour and substrate range of soil-derived methanol-utilising methylotrophs was enabled by slurry incubations, which were treated under methylotrophic and mixed substrate conditions. The studies combined comparative stable isotope probing (SIP) experiments and next generation sequencing (NGS) techniques with general (16S rRNA, ITS) and methylotrophic specific (mxaF/xoxF, cmuA) marker genes. In this way, members of the Rhizobiales were identified as methanol-utilisers of which Beijerinckiaceae were the main methanol-utilisers. Beijerinckiaceae occupied a central role in a methanol-dependent food web including other non-methylotrophic Bacteria (i.e., Acidobacteria, Actinobacteria, Planctomycetes and Verrucomicrobia) as well as fungi (Trichosporon, Cryptococcus, Mortierella). The identified substrate range of methylotrophic Beijerinckiaceae was restricted to C1 compounds rather than multi-carbon compounds. Other methanol-utilisers, such as Methylobacteriaceae and Hyphomicrobiaceae, likely possessed a larger substrate range including acetate, sugars, and aromatic compounds. Moreover, an unexpected diversity of chloromethane utilisers was uncovered comprising taxa affiliated to Alphaproteobacteria (i.e., Beijerinckiaceae, Methylobacteriaceae, Hyphomicrobiaceae, and Bradyrhizobiaceae) as well as Actinobacteria (i.e., Actinomycetales, Pseudonocardiaceae, and Microbacteriaceae). These chloromethane-utilising taxa were further classified as different ‘trophic types’, regarding to the utilisation of methanol and chloromethane as carbon and/or energy sources. Furthermore, an experimentally induced pH shift was associated with substantial changes in the active methylotrophic community, suggesting that the soil pH was a crucial niche-defining factor of the detectable methanol utilisers. Under neutral but still methylotrophic conditions Bacteroidetes (Flavobacteriaceae), Actinobacteria (Microbacteriaceae), and Beta-proteobacteria (Methylophiliaceae) as well as the yeast Trichosporon were identified as methanol utilisers. The conclusions of the current work are therefore (i) that acidotolerant methylotrophic Rhizobiales, especially Beijerinckiaceae, contribute to the main methanol sink in an acidic forest soil, (ii) that soil-derived methylotrophs seem to possess a limited substrate range including methane, methanol, and chloromethane regarding carbon assimilation under environmental conditions, (iii) that the soil’s pH is a crucial ecological niche-defining factor, and (iv) that saprotrophic fungi and further soil Bacteria are tightly trophically linked to methylotrophs in a complex microbial community in the investigated forest soil.

Abstract in weiterer Sprache

Methylotrophe Mikroorganismen besitzen einen einzigartigen Metabolismus, der es ihnen ermöglicht, C1-Verbindungen als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen. Deshalb sind Methylotrophe eine wichtige Senke für gasförmige C1-Verbindungen wie Methan, Methanol und Chlormethan, die für die Atmosphärechemie relevant sind. Diese flüchtigen organischen Verbindungen (VOC, volatile organic compounds) beeinflussen das Klima und die Chemie der Atmosphäre. Obwohl methylotrophe Mikroorganismen seit dem letzten Jahrhundert Forschungsgegenstand sind, ist das Wissen über die Umweltfaktoren, die deren Biodiversität steuern, begrenzt. Die meisten aus dem Boden gewonnenen Isolate sind neutrophil und fakultativ methylotroph, was bedeutet, dass sie in der Lage sind Mehrfachkohlenstoffverbindungen zu nutzen. Aus diesem Grund könnten das Substratspektrum sowie der pH-Wert wichtige Faktoren sein, die die ökologische Nische von Methylotrophen in einer komplexen mikrobiellen Gemeinschaft bestimmen. In der vorliegenden Arbeit wurden aerobe Methylotrophe in einem sauren Laubwaldboden bezogen auf ihre Diversität, ihr Substratspektrum hinsichtlich verschiedener C1-Verbindungen und ihrer Fähigkeit Mehrfachkohlenstoffverbindungen zu assimilieren, sowie den Effekt des pH-Wertes im Boden analysiert. Langzeitinkubationen unter methanotrophen und gemischten Substratbedingungen, die sich auf das Methanabbaupotenzial eines Waldbodens, die Abundanz der „hochaffinen“ USCα Methanotrophen (basierend auf qPCR Analysen des pmoA-Gens von USCα) und deren Substratspektrum konzentrierten, ergaben ein sehr eingegrenztes Substratspektrum, das sich scheinbar nur auf Methan beschränkt. Aus diesem Grund konnte die Vorstellung, dass „hochaffine“ Methanotrophe wie USCα alternative kohlenstoffhaltige Substrate außer Methan nutzen können, nicht bestätigt werden. Einblicke in das Stoffwechselverhalten und das Substratspektrum bodenbürtiger Methylotrophen, die Methanol nutzen können, wurden durch Inkubationsstudien unter methylotrophen und gemischten Substratbedingungen ermöglicht. Diese Experimente kombinierten vergleichende stabile Isotopensondierungsexperimente (SIP, stable isotope probing) und Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken (NGS) auf Grundlage allgemeiner (16S rRNA, ITS) und methylotroph-spezifischer (mxaF/xoxF, cmuA) Genmarker. So wurden Angehörige der Rhizobiales als Methanolnutzer identifiziert, wobei Beijerinckiaceae die Hauptnutzer von Methanol waren. Beijerinckiaceae nahmen dabei eine zentrale Rolle in einem methanol-abhängigen Nahrungsnetz ein, das andere Bakterien (Acidobacteria, Actinobacteria, Planctomycetes und Verrucomicrobia) sowie Pilze (Trichosporon, Cryptococcus, Mortierella) umfasste. Die als assimiliert identifizierten Substrate der methylotrophen Beijerinckiaceae waren ausschließlich C1-Verbindungen und keine Mehrfachkohlenstoffverbindungen. Bei anderen Methanolnutzern wie z.B. Methylobacteriaceae und Hyphomicrobiaceae wurde ein breiteres Substratspektrum detektiert, welches Acetat, Zucker und Aromaten einschloss. Außerdem wurde eine unerwartete hohe Diversität chlormethannutzender Taxa identifiziert, die den Alphaproteobacteria (Beijerinckiaceae, Methylobacteriaceae, Hyphomicrobiaceae und Bradyrhizobiaceae) sowie Actinobacteria (Actinomycetales, Pseudonocardiaceae und Microbacteriaceae) zuzuordnen sind. Diese chlormethannutzenden Taxa konnten zudem in verschiedene „trophische Typen“ hinsichtlich der Nutzung von Methanol und Chlormethan als Kohlenstoff- und/oder Energiequelle eingeteilt werden. Darüber hinaus führte eine experimentell induzierte Verschiebung des pH-Wertes zu erheblichen Änderungen der aktiven methylotrophen Gemeinschaft, was darauf hindeutet, dass der pH-Wert des Bodens ein entscheidender nischenbestimmender Faktor für die detektierten Methanolnutzer ist. Unter pH-neutralen, aber dennoch methylotrophen Bedingungen wurden Bacteroidetes (Flavobacteriaceae), Actinobacteria (Microbacteriaceae) und Betaproteobacteria (Methylophiliaceae) sowie die Hefe Trichosporon als Methanolnutzer identifiziert. Aus den dargestellten Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, (i) dass acidotolerante methylotrophe Rhizobiales, vor allem Beijerinckiaceae, die Hauptsenke von Methanol in dem untersuchten sauren Waldboden waren; (ii) dass Methylotrophen des untersuchten Waldbodens nur ein limitiertes Substratspektrum besitzen, das Methan, Methanol und Chlormethan umfasst; (iii) dass der pH-Wert des Bodens ein entscheidender Faktor ist, der die ökologische Nische dieser Mikroorganismen bestimmt; und (iv) dass saprotrophe Pilze und andere Bakterien in dem untersuchten Waldboden trophisch eng mit Methylotrophen verbunden sind.