Development of Bacillus subtilis spores and cells for surface display of proteins

Titelangaben

Nguyen, Quynh Anh:
Development of Bacillus subtilis spores and cells for surface display of proteins.
Bayreuth , 2011
( Dissertation, 2011 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Surface display has attracted the attention of researchers in developing efficient display systems expressing heterologous polypeptides on the surface of bioparticles such as phages, bacterial and eukaryotic cells and bacterial spores. Among these bioparticles, the endospore from B. subtilis has advantages, including feasibility of production, safety feature, the robustness of the bacterial spore allowing storage in the desiccated form, a technological platform supported by extensive tools for genetic manipulation and less size restrictions of the displayed proteins compared to cell- and phage-based systems. A strategy to engineer B. subtilis spores to display heterologous protein on their surface is to use outer spore coat proteins (CotB, CotC, CotG) or an inner-coat protein (OxdD) with the coat genes’ transcriptional and translational signals as carriers (Isticato et al., 2001; Mauriello et al., 2004; Hinc et al., 2010; Zhou et al., 2008a; Potot et al., 2010; Kim et al., 2005a; Kwon et al., 2007). This strategy guarantees the timing for fusion protein synthesis during coat formation, but the amount of produced fusion proteins cannot be controlled. Therefore, the first aim of this doctoral thesis focused on construction of more effective expression systems for spore surface protein anchoring. A novel approach of substitution of native promoter by two different IPTG-inducible promoters to the increase the production of fusion protein is presented here. CotB was used and the expression of the cotB gene was regulated by either its own promoter, the Pgrac and the PSgrac promoter in a series of plasmids which can be integrated into or replicated independently of the B. subtilis chromosomal DNA. Two reporter proteins, α-amylase Q from B. amyloliquefaciens (AmyQ) (Palva, 1982) and GFPuv – an enhanced version from the GFP protein of the jellyfish Aequorea victoria (Crameri et al., 1996), were fused downstream of the CotB protein. To assess the enhancement of GFPuv displayed on the spore surface, CotC and CotG were similarly examined. The results indicated that the Pgrac promoter is a suitable, hence recommended as a promoter of choice. Substitution of the native promoter by Pgrac promoter, the amount of proteins displayed per spore can be increased two-fold. Furthermore, the display of heterologous proteins on the spore surface when using different carriers is gene dosage dependent. And for the first time, the tendency of the three Cot proteins’ localization on the spore coat compartment is reported using the GFPuv tag. Second, a new B. subtilis spore-based system for protein expression and purification was developed. Using this system, proteins prone to form inclusion bodies can be anchored on the spore surface, separated by a mini-intein derived from the SSp DnaB, which was then used as self-cleaving tag for purification by shifting the pH and/or temperature conditions, with no addition of any proteases or thiol reagent (Mathys et al., 1999). To construct the system, the mini-intein was fused downstream of the CotB protein, followed by the reporter protein AmyQ. By changing the pH of the buffer, the mini-intein self-cleaving process was induced followed by the release of α-amylase into the supernatants. This observation suggests the use of the B. subtilis spores as an effective and low cost tool for protein purification. However, concerns related to premature of the pH-inducible mini-intein and auto-release of coat protein raise the question about the stability of the fusion coat-heterologous protein on the spore surface using the system. Hence, further investigation is needed to achieve a usable spore-based purification system. The last aim of the thesis was to apply the newly constructed B. subtilis spore display and the cell surface display systems (Nguyen and Schumann, 2006) to generate cellulose chips, in which enzymes were immobilized on the surface of microorganism cells or spores. The cellulase A (CelA) from C. thermocellum (Beguin et al., 1985) was utilized as a model enzyme. Unfortunately, the results showed an ineffective anchoring of CelA on the cell wall. This indicates the unsuccessful creation of cell-based cellulase chip when using the SrtA transpeptidase. In contrast, CelA was verified to be successfully displayed on the spore surface using CotB and CotG, but not CotC, as carriers. In general, a large volume of culture (up to one liter) must be prepared containing both cells and spores displaying CelA on the surface to assure sufficient CMC degradation. This might indicate a low activity of CelA. Further works should be done in selection of cellulase and improvement of the systems to generate the more effective cellulase chips.

Abstract in weiterer Sprache

Die Möglichkeit der Verankerung von Proteinen auf der Oberfläche von Biopartikeln (Phagen, bakterielle und eukaryotische Zellen und bakterielle Sporen) hat Wissenschaftler veranlasst, eine Reihe verschiedener Verankerungssysteme zu entwickeln. Unter den verwendeten Systemen besitzen die Endosporen (Sporen) von Bacillus subtilis folgende Vorteile: einfache Produktion, Sicherheit, hohe Stabilität der Sporen bei ihrer Lagerung in getrockneter Form, viele Techniken der genetischen Manipulation verfügbar und weniger Probleme bei der Länge der verankerten Proteine im Vergleich zu Zell- und Phagen-basierten Systemen. Eine Strategie zur Nutzung von B. subtilis-Sporen um heterologe Proteine auf der Sporenoberfläche zu präsentieren besteht in der Nutzung von Proteinen der äußeren Sporenhülle (CotB, CotC, CotG) oder der inneren Sporenhülle (OxdD) unter Verwendung der Transkriptions- und Translations-Signale dieser Proteine als Carrier. Diese Strategie garantiert die Verankerung der Fusionsproteine auf der Sporenoberfläche, aber die Menge an produziertem Protein kann nicht kontrolliert werden. Daher war das erste Ziel dieser Dissertation die Konstruktion eines effektiven Expressionssystems zur Verankerung von Proteinen auf der Oberfläche von Sporen. Es basiert auf der Substitution nativer Promotoren durch zwei verschiedene IPTG-induzierbare Promotoren. Das CotB-Protein wurde zur Verankerung benutzt, und die Expression des cotB-Gens erfolgte einmal über den eigenen Promotor, den Pgrac und den PSgrac Promotor (beides IPTG-induzierbare Promotoren) als Teil von integrativen oder autonom replizierenden Plasmiden. Zwei verschiedene Reporter-Proteine, die *-Amylase Q von B. amyloliquefaciens (AmyQ) und GFPuv, eine Variante von GFP aus der Qualle Aequoria victoria mit erhöhter Aktivität, wurden zunächst an das CotB-Protein, dann auch an CotC und CotG fusioniert. Bei nachfolgenden Messungen erwies sich der Pgrac-Promotor als der Promotor der Wahl. Verglichen mit den nativen Promotoren führte er zu einer Verdoppelung der Menge verankertem Protein. Außerdem ist die Menge an verankertem Protein abhängig von der Gen-Dosis. Unter Verwendung des GFP-Tags konnten die drei Cot-Proteine zum ersten Mal direkt in der Sporenhülle lokalisiert werden. Das zweite Ziel war die Entwicklung eines Sporen-basierten Expressions- und Reinigungssystems für rekombinante Proteine. Basierend auf diesem System sollten Proteine, die nach cytoplasmatischer Überexpression Aggregate bilden, auf der Sporenoberfläche verankert werden. Dabei wurde zwischen dem Carrier-Protein (einem Cot-Protein) und dem rekombinanten Protein ein Mini-Intein eingefügt, welches in der Art und Weise verändert war, dass es nur noch die Spaltstelle zwischen dem Intein und dem rekombinanten Protein nach Aktivierung endonucleolytisch spaltet. Im vorliegenden Fall stammte das Mini-Intein von dem Ssp dnaB-Gen, wobei seine Protease-Aktivität durch Erniedrigung des pH-Wertes im LB-Medium induziert wurde. Im vorliegenden Fall wurde das Mini-Intein zwischen CotB and AmyQ eingebaut, und die Abspaltung von AmyQ an gereinigten Sporen durch Messung der *-Amylase Aktivität im Überstand gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass Sporen als Carrier für rekombinante Proteine benutzt werden können. Allerdings kommt es unter den getesteten Bedingungen auch zu einer pH-Wert unabhängigen Aktivierung der Protease-Aktivität des Mini-Inteins. Daher sind weitere Experimente notwenig, um das System zu optimieren. Das dritte Ziel der Dissertation war die Entwicklung von Cellulose-Chips durch Verankerung von Cellulasen auf der Zelloberfläche und auf Sporen. Die Verankerung auf der Zelloberfläche sollte mittels eines Sortase-Systems erfolgen. Als Modell-Cellulase wurde CelA aus Clostridium thermocellum ausgewählt. Allerdings erwies sich die Verankerung von CelA auf der Zelloberfläche als ineffektiv. Dies könnte auf einer ineffizienten Interaktion zwischen der Cellulase und der Sortase hinweisen. Im Gegensatz dazu konnte CelA erfolgreich auf der Sporenoberfläche verankert werden, wenn CotB oder CotG als Carrier-Protein verwendet wurden. Um den Abbau von CMC nachzuweisen, mussten Zellen oder Sporen aus bis zu einem Liter präpariert werden. Dies deutet auf eine geringe Aktivität von CelA hin. Weitere Studien sollten mit anderen Cellulasen durchgeführt werden, um Cellulase-Chips zu optimieren.