Synthese von Glycoformen lysosomaler Sphingolipidaktivatorproteine

Titelangaben

Graf, Christopher G. F.:
Synthese von Glycoformen lysosomaler Sphingolipidaktivatorproteine.
Bayreuth , 2017 . - 181 S.
( Dissertation, 2017 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die Glycosylierung von Proteinen stellt eine wichtige Modifikation mit vielen resultierenden Funktionen dar. Die Isolierung einheitlicher Glycoformen ist jedoch bisher nicht möglich. Solch homogene Referenzen sind allerdings nötig, um Glycoproteine in Bezug auf die unterschiedlichen Saccharidanteile zu erforschen. Deshalb wurden in dieser Arbeit Synthesemethoden zur Gewinnung einheitlicher Glycoproteine entwickelt. Eine effiziente Methode zur Synthese von Glycopeptiden ist die konvergente LANSBURY-Aspartylierung, bei der das Peptid nachträglich mit dem Glycan verknüpft wird. Nachteilig hierbei ist, dass es häufig zur Bildung eines Aspartimidnebenprodukts kommt. Der genaue Einfluss der Peptidstruktur auf die Aspartimidbildung konnte bisher nicht geklärt werden. Daher wurde durch die Synthese verschiedener peptidischer Testsysteme versucht, weitere Erkenntnisse über den Mechanismus zu gewinnen. Es konnte gezeigt werden, dass für die basenkatalysierte Cyclisierung die Anwesenheit eines Amidprotons in Position n+2 zum Aspartat essentiell ist. Auf den Ergebnissen beruhend wurde ein H-Brücken-stabilisiertes bicyclisches Intermediat postuliert. Weiterhin konnten die für geschützte Peptide gewonnenen Erkenntnisse über die Aspartimidbildung auch bei nativen Peptiden gezeigt werden. Hierfür wurden modifizierte Peptide aus der Sequenz des Peptidhormons ACTH verwendet. Die mechanistischen Erkenntnisse sollten zum Verständnis der Stabilität von Peptiden und Proteinen beitragen. Für die Synthese der glycosylierten Fc-Domäne des Immunglobulins G1 wurde der Peptidthioester IgG1 Fc 223-260 19 aufgebaut. Durch die verbesserte Abspaltung des Peptids vom Harz konnte der Peptidthioester 19 in höherer Gesamtausbeute erhalten werden. Zur Synthese von 3-fach glycosyliertem humanem EPO beruhend auf Alanin-Ligationen wurden zwei Schutzgruppenstrategien für die nativen Cysteine 29 und 33 getestet. Dazu wurde das EPO 29-67 Hydrazid 21e synthetisiert, bei dem beide Cysteine mit einer Phacm-Gruppe geschützt waren. Eine vollständige Abspaltung beider Phacm-Gruppen durch AgI- und HgII-Salze konnte nicht erreicht werden. Als alternative Schutzgruppen für beide Cysteine wurden Tritylthioether eingesetzt. Diese konnten chemoselektiv an den Cysteinen des vollständig entschützten Glycopeptidhydrazids EPO 29-67 28 angebracht werden. Die Ligation des S-tritylierten Glycopeptids zum biglycosylierten EPO 29-97 Hydrazid 32 gelang mit guter Ausbeute. Auf Grund der geringen Löslichkeit des doppelt tritylierten Ligationsprodukts 32 konnte die Synthese jedoch nicht beliebig skaliert werden. Die Darstellung des biglycosylierten EPO 29-97 Peptidthioesters 33 war durch die hydrophoben Tritylgruppen erschwert. Für Saposin D konnte eine effiziente Synthesemethode durch NCL und anschließender oxidativer Rückfaltung etabliert werden. Hierfür wurden drei Saposin D 1-35 Glyco-peptidthioester 40a-c durch konvergente Glycopeptidsynthese dargestellt. Das hydrophobe Cysteinfragment Saposin D 36-82 42 wurde durch optimierte Fmoc-SPPS, Festphasen-extraktion und RP-HPLC gewonnen. Nach NCL mit den Glycopeptidthioestern 40a-c zu den Volllängenproteinen konnte eine Rückfaltung durch anaerobe Dialyse und anschließende Luftoxidation etabliert werden. Diese Methode lieferte die drei Glycoformen 44a-c des Saposins D in guten Ausbeuten. Die Kristallisation von Saposin D (GlcNAc) 44a und eine röntgenkristallographische Analyse zeigten die native Struktur des synthetischen Saposins D. Durch Struktur-Aktivitäts-Tests von 44a-c konnte zum ersten Mal eine Kohlenhydrat-abhängige Bioaktivität von Saposin D nachgewiesen werden. Die für Saposin D entwickelte Synthesestrategie wurde auf Saposin B und C übertragen. Die Fragmente Saposin B 36-81 51 und Saposin C 36-81 58 konnten durch Fmoc-SPPS gewonnen werden. Die Synthese der Saposin B 1-35 (GlcNAc/Nona) Glycopeptidhydrazide 48a,b gelang jedoch nur in niedrigen Ausbeuten, was auf einer starken Aggregation der Glycopeptide bei sauren Bedingungen beruht. Eine Thioveresterung der Hydrazide 48a,b war nicht möglich. Die Saposin C 1-35 (GlcNAc/Nona) Glycopeptidthioester 56a,b waren gut zugänglich. Hierfür war die Entwicklung von speziellen Desallylierungsbedingungen notwendig. Die Ligation und die oxidative Rückfaltung beider Glycoformen konnten mit guten Ausbeuten durchgeführt werden. Dadurch konnte eine effiziente Synthesemethode für Saposin C etabliert werden, welche die homogenen Glycoformen 60a,b lieferte.

Abstract in weiterer Sprache

Glycosylation is an important protein modification with many resulting functions. However the isolation of homogeneous glycoforms is not possible so far. Certainly such uniform samples are necessary to explore glycoproteins in relation to their different saccharide moiety. Therefore synthesis methods for homogeneous glycoproteins have been developed in this thesis. An efficient technique for the synthesis of glycopeptides is the convergent LANSBURY-Aspartylation, in which the glycan is linked to the peptide subsequently. Adversely in this case, an aspartimide side product is formed often. The exact influence on the aspartimide formation of the peptide structure could not be explained so far. Therefore the attempt was to gain further knowledge of the mechanism by the synthesis of different peptide test systems. It has been shown that the presence of the amide proton in position n+2 to the aspartate is essential for the base catalyzed cyclisation. Based on the results an H-bridge stabilized bicyclic intermediate was postulated. Furthermore the perceptions of the aspartamide formation for protected peptides could also be shown for native peptides. Therefor modified peptides from the sequence of the peptide hormone ACTH were used. The mechanistic awareness should contribute to the understanding of peptide and protein stability. For the synthesis of the glycosylated Fc-domain of the immunglobuline G1 the peptide thioester IgG1 Fc 223-260 19 was synthesized. The peptide thioester 19 was obtained in higher overall yield by an improved peptide cleavage from resin. For the synthesis of 3-fold glycosylated human EPO based on alanine ligations two protecting group strategies have been examined for the native cysteine 29 and 33. Therefore the EPO 29-67 hydrazide 21e was synthesized, in which both cysteines were protected by a Phacm group. Complete cleavage of both Phacm groups could not be achieved by AgI and HgII salts. Trityl thioethers were applied as alternative protecting groups for both cysteines. Those could be attached to the cysteines of the completely deprotected glycopeptide hydrazide 28 chemoselectively. The ligation of the S-tritylated glycopeptide to the biglycosylated EPO 29-97 hydrazide 32 succeeded with good yield. However the synthesis could not be scaled randomly, because of the low solubility of the bitritylated ligation product 32. Synthesis of the biglycosylated EPO 29-97 peptide thioester 33 was difficult due to the hydrophobic trityl groups. For Saposin D an efficient synthesis method by NCL and subsequent oxidative refolding was established. Therefor three Saposin D 1-35 glycopeptide thioesters 40a-c were produced by convergent glycopeptide synthesis. The hydrophobic cysteine fragment Saposin D 36-82 42 was obtained by an optimized Fmoc-SPPS, solid phase extraction and RP-HPLC. After NCL with the glycopeptide thioesters 40a-c yielding the full-length proteins refolding by anaerobic dialysis and subsequent air oxidation was established. This method provided the three Glycoforms 44a-c of Saposin D in good yields. Crystallisation of Saposin D (GlcNAc) 44a and X-ray analysis showed the native structure of the synthetic Saposin D. For the first time structure-activity relationship studies of 44a-c revealed carbohydrate depending bioactivity of Saposin D. The synthesis strategy developed for Saposin D was applied to Saposin B and C. The fragments Saposin B 36-81 51 and Saposin C 36-81 58 were obtained by Fmoc-SPPS. The synthesis of the Saposin B 1-35 (GlcNAc/Nona) glycopeptide hydrazides 48a,b succeeded, but merely with low yields, resulting from a strong aggregation of the glycopeptides unter acidic conditions. Thioesterfication of the Hydrazids 48a,b was not possible. Saposin C 1-35 (GlcNac/Nona) glycopeptide thioesters 56a,b were readily accessible. Therefor the development of special deallylation conditions was necessary. The ligation and oxidative refolding of both glycoforms could be performed with good yields. Thus an efficient synthesis method was established for Saposin C, which provided the homogeneous glycoforms 60a,b.