Herstellung und Charakterisierung Artifizieller Assemblierungsmorphologien und Komposit-Materialien aus Rekombinanten Spinnenseidenproteinen

Titelangaben

Doblhofer, Elena:
Herstellung und Charakterisierung Artifizieller Assemblierungsmorphologien und Komposit-Materialien aus Rekombinanten Spinnenseidenproteinen.
Bayreuth , 2016 . - VI, 158 S.
( Dissertation, 2017 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

In den letzten Jahrzehnten waren vor allem Kunststoffe aus synthetischen Polymeren für den enormen technischen und medizinischen Fortschritt der Menschheit verantwortlich. Dabei zeigte sich aber schon bald nach ihrer Kommerzialisierung auch die Kehrseite dieser vielseitigen und kostengünstigen Materialien. Das Auffinden von Plastikteilen in verendeten Seevögeln und Mikroplastik in marinen Habitaten, sowie den damit verbundenen Folgen bewegte Wissenschaftler dazu, Alternativen zu petrochemisch hergestellten und nicht bioabbaubaren Stoffen zu finden. In diesem Zusammenhang rückten bioabbaubare Materialien aus nachwachsenden Rohstoffen zwar bereits in den Fokus der Wissenschaft, konnten jedoch bisher nur wenige kommerzielle Anwendungen finden. Die Gründe dafür waren meist die teure Produktion und nur geringe Verfügbarkeit in ausreichender Qualität. Eine Materialklasse, die als Ersatz für synthetische Polymere fungieren kann, sind Proteine. Sie sind bioabbaubar und stellen eine Vielzahl an funktionellen Gruppen zur Modifikation zur Verfügung. Rekombinante Spinnenseidenproteine bieten aufgrund biotechnologischer Herstellung eine einfache Möglichkeit zur Modifikation der Primärstruktur auf Basis einer Änderung der Gensequenz und gewährleisten zusätzlich hohe Reinheit. Spinnenseidenproteine sind außerdem nur wenig immunogen, nicht toxisch und Materialien daraus weisen eine gute mechanische Belastbarkeit auf. In den letzten Jahren wurde daher vor allem das anionische, rekombinante Spinnenseidenprotein eADF4(C16) aus der Konsensussequenz der repetitiven Kerndomäne des Dragline- Seidenproteins ADF4 (Araneus diadematus Fibroin) der europäischen Gartenkreuzspinne abgeleitet und etabliert. Dieses eignete sich aufgrund seiner negativen Nettoladung vor allem für Wechselwirkungen mit positiv geladenen Substanzen, sowie für Anwendungen in denen nur geringe Interaktion zwischen Zellen und Proteinoberfläche gewünscht ist (z.B. Beschichtungen für Implantate). Um eine Erweiterung der Anwendbarkeit von rekombinanten Spinnenseidenproteinen zu erreichen, lag der Fokus der vorliegenden Dissertation in der Entwicklung eines polykationischen, rekombinanten Spinnenseidenproteins, eADF4(ĸ16) genannt. Hierfür wurde die Aminosäure L- Glutaminsäure (bei pH 7 negativ geladen) in jedem C-Modul von eADF4(C16), gegen die Aminosäure L-Lysin (bei pH 7 positiv geladen) ausgetauscht. Nach erfolgreicher ZUSAMMENFASSUNG 1 Herstellung und Reinigung dieses Proteins wurde dessen Anwendung in Form zweier verschiedener Assemblierungsmorphologien getestet. Im ersten Teil konnte gezeigt werden, dass aus eADF4(ĸ16) sphärische Partikel durch Präzipitation mittels kosmotroper Salze hergestellt werden konnten, die als Wirkstofftransportsysteme Anwendung finden. Analysen der Interaktion der eADF4(ĸ16) Partikel mit niedermolekularen Modellwirkstoffen ergaben daraufhin, dass zwar negativ geladene Modellwirkstoffe in den Spinnenseidenproteinpartikeln aufgenommen werden konnten, diese aber nur eine geringe elektrostatische Interaktion zwischen den Modellsubstanzen und der Proteinmatrix aufwiesen. So führte eine Inkubation der beladenen Partikel unter physiologischen Bedingungen zur Freisetzung der Modellsubstanz innerhalb von einigen Minuten. Ein anschließender Versuch durch Einkapseln der Modellsubstanz mittels Layer-by-Layer-Technik, bei der das entgegengesetzt geladene Spinnenseidenprotein eADF4(C16) für die Hülle verwendet wurde, führte entgegen der Erwartungen nicht zu einer Verzögerung der Substanzfreisetzung. Im Gegensatz zu niedermolekularen Modellsubstanzen zeigten größere Moleküle mit negativer Ladung, wie zum Beispiel kurze DNA-Stränge, die als Modell für siRNA fungieren können, eine verlangsamte Diffusion unter physiologischen Bedingungen. So konnte eine retardierte Freisetzung beobachtet werden, wodurch sich Partikel aus eADF4(ĸ16) als potentielles Transportsystem zur systemischen Applikation von gentherapeutischen Medikationen unter Nutzung des EPR (engl. enhanced permeability and retention = erhöhte Permeabilität und Retention) -Effekts qualifizierten. Da gentherapeutische Medikamente nach Erreichen des Zielgewebes vor allem intrazellulär wirken, wurde in einem zweiten Teil dieser Arbeit die Auswirkung der Beladung der eADF4(ĸ16) Partikel mit kurzen DNA-Strängen auf die Aufnahme in eukaryotischen Zellen analysiert. Während die Partikel ohne Cargo aufgrund guter elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen Zellwand und Partikel in hohem Maß von HeLa-Zellen aufgenommen wurden, führte die Beladung der Partikel mit einzelsträngigen, fluoreszenz-markierten DNA-Molekülen zu einer stark verringerten Aufnahme. Die Annahme einer veränderten zellulären Aufnahme aufgrund einer Veränderung der elektroosmotischen Eigenschaften der Partikel durch Ablage der DNA-Moleküle auf der Partikeloberfläche konnte jedoch nicht experimentell bestätigt werden, wodurch die Ursache ungeklärt blieb. Eine erneute Beschichtung durch Inkubation der beladenen ZUSAMMENFASSUNG 2 Partikel in einer eADF4(ĸ16)-Lösung konnte den Effekt auf die Aufnahme der Partikel durch die Beladung revidieren. Um aus rekombinanten Spinnenseidenproteinen hergestellte Partikel industriell für Arzneimittelformulierungen produzieren zu können, müssen Kontrollmethoden für eine gleichbleibende Qualität etabliert werden. Hierfür wurde in dieser Arbeit die Kombination aus elektroosmotischen und kolloidalen Eigenschaften der Partikel analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die betreffenden Materialparameter in den unterschiedlichen Herstellungschargen innerhalb der gleichen Partikelart stark unterscheiden. Abweichungen sind wahrscheinlich auf Unterschiede in den Dichteprofilen der Partikel zurückzuführen, die aus geringen Modifikationen der Produktionsparameter bei manueller Herstellung der Partikel mittels Salzfällung resultieren. Die Bestimmung der elektrophoretischen Mobilität von Partikeln aus rekombinanten Spinnenseidenproteinen bei niedrigen Salzkonzentrationen bietet daher eine direkte Möglichkeit die Oberfläche der Partikel effektiv zu analysieren und somit die Gleichheit verschiedener Partikelchargen zu garantieren. In einem zweiten Teil der vorliegenden Dissertation wurde die Verwendung von Filmen des neu entwickelten rekombinanten Spinnenseidenproteins im technischen Anwendungsbereich analysiert. Dabei wurde beispielhaft ein Nanokomposit aus dem synthetischen Schichtsilikat Natrium-Hektorit und dem Spinnenseidenprotein eADF4(ĸ16) entwickelt, welches durch Aufbringen auf eine PET (Polyethylentherephthalat)-Folie deren Permeabilität um das 600-fache verringern konnte. Diese Werte übersteigen die Leistungsfähigkeit häufig verwendeter V erpackungsmaterialien in der Lebensmittelindustrie, wie z.B. PVDC (Polyvinylidenchlorid), um das 60-fache. Die Herstellung der genannten Beschichtung verlief dabei in einem einfachen, wasserbasierten Prozess ohne Additive und unter Verwendung von umweltfreundlichen, bioabbaubaren und nachhaltigen Materialien. Eine einzigartige Kombination von chemischer und mechanischer Stabilität mit hoher Sauerstoff- und Wasserdampfbarriere sowie einer wasserbasierten Herstellung machen die hier gezeigte Beschichtung geeignet für die Verwendung in Lebensmittelverpackungen.

Abstract in weiterer Sprache

Over the last few decades, plastics made of synthetic polymers were in the focus of scientific research and their use resulted in enormous medical and technical advances of mankind. However, shortly after industrial production of plastics, negative influences of this material on nature became apparent: Plastic fragments were found in perished sea birds and micro plastic was spotted in remote marine habitats. These occurrences and the consequences thereof encouraged scientists to look for non-petrochemical and biodegradable materials which can still be used in a great variety of applications. One class of material that can be used as a substitute for synthetic polymers is the class of proteins. Protein materials are biodegradable and provide a large variety of functional groups for modification. In contrast to most other proteins, recombinantly produced spider silk proteins offer the possibility for modification of the primary structure as well as high purity, due to their biotechnological production. Recombinant spider silk proteins, furthermore, have low-immunogenicity, are non-toxic and morphologies made of these proteins exhibit high mechanical stability. Recently, the anionic recombinant spider silk protein eADF4(C16) was designed based on the repetitive core of the natural spider silk protein ADF4 (Araneus diadematus fibroin 4) which can be found in the dragline silk of the European garden spider. Due to its negative net charge eADF4(C16) is especially suitable for applications in which good interactions with positively charged substances, as well as no interactions between cells and protein surfaces are required. For an extended application range of recombinant spider silk proteins, this work focused on the development of a new and positively charged variant of eADF4 and its medical and technical applications. Therefore, every codon for L-glutamic acid (negatively charged at pH 7) of in the DNA template of eADF4(C16) was exchanged by a codon for L-lysine (positively charged at pH 7). The resulting protein was named eADF4(ĸ16) and exhibits 16 positive net charges. After successful production and purification, this protein was tested for its possible applications in two different assembly morphologies. In a first part of this work, spherical particles made of eADF4(ĸ16) were produced and analyzed for their suitability as drug delivery vehicles. The resulting cationic particles were loaded with negatively charged small model substances by electrostatic interactions in a salt-free environment. However, the interactions of the particle matrix and the model SUMMARY 4 substances were weak, and a rapid release of the cargo (in the range of a few minutes) was observed under physiological conditions. A layer-by-layer approach to encapsulate the loaded particles with the oppositely charged eADF4(C16) did not lead to a retardation of the model substance release. Unlike small model substances, larger molecules with a high negative net charge, like short DNA strands that can be used as model for siRNA, showed a slower release profile. In this case, continuous, retarded release could be detected. These findings qualified eADF4(ĸ16) particles as suitable carriers to be used in gene therapy utilizing the EPR (enhanced permeability and retention)-Effect. Since drugs used in gene therapy operate in an intracellular environment after reaching the target tissue, the cellular uptake efficiency of eADF4(ĸ16) particles carrying DNA cargo were tested in a further study. Therein it was shown that eADF4(ĸ16) particles without cargo were taken up by HeLa cells with high efficiency, whereas DNA loaded particles were not. It is possible that the decreased uptake was due to changed electroosmotic properties, because of deposition of the DNA strands on the particle’s surface, however, this could not be proofed. Therefore, the mechanism behind the obtained decreased uptake remained unclear. By coating the loaded eADF4(ĸ16) particles, the uptake rate was returned to a value similar to unloaded particles and the particles were again proven suitable to carry large negatively charged model substances into eukaryotic cells. To use the described particles made of recombinant spider silk protein commercially in drug formulations, their consistent quality must be guaranteed. Therefore, analysis of electroosmotic and colloidal properties was established to examine the similarity of different particle batches. From this analysis, it could be shown that there is a large variability between the single batches. This could be due to divergence of production parameters, due to a manually performed production process. Nevertheless, this study showed that analysis of the electroosmotic and colloidal properties of the particles provide the opportunity to validate the similarity of different particle batches. In a second part of this dissertation, the use of the newly developed cationic recombinant spider silk protein eADF4(ĸ16) in technical applications was tested. As an example, a nanocomposite made of the synthetic layered silicate sodium hectorite as filler and the biodegradable biopolymer eADF4(ĸ16) matrix was developed. This nanocomposite was produced in a fully aqueous process without any additives by a simple SUMMARY 5 drop casting method. Drop casting of this composite on a PET-foil resulted in a 600-fold reduction of the permeability of the foil. Surprisingly, this nanocomposite coating was, though produced in an all aqueous process, completely water insoluble, which is yet to be accomplished by any other biodegradable, water-based barrier nanocomposite developed in the past. Additionally, the resulting coated PET-foil permeability performance even surpassed other commercially used packaging materials in food industry a 60-fold (e.g. PVDC (Polyvinylidenchlorid)). This unique combination of chemical and mechanical stability with high oxygen and water vapor barrier properties, produced in a fully aqueous production process, makes the coating suitable to develop sustainable packaging materials.