Protection of Centriole Engagement in Mitosis by Alternatively Spliced Shugoshin1 Isoforms in Complex with Protein Phosphatase 2A

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Mohr, Lisa:
Protection of Centriole Engagement in Mitosis by Alternatively Spliced Shugoshin1 Isoforms in Complex with Protein Phosphatase 2A.
Bayreuth , 2016 . - 144 S.
( Dissertation, 2016 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Maintaining genome stability requires the chromosome cycle to be coordinated with the centrosome cycle. The challenges of this choreography might partly be met by dual use of the multi-protein complex cohesin in both sister chromatid cohesion and centriole pairing ("engagement"). Chromatin-bound cohesin is removed from chromosome arms by the prophase pathway but protected at centromeres by shugoshin 1 (Sgo1) and associated protein phosphatase 2A (PP2A) until cohesin's Scc1 subunit is proteolytically cleaved at the metaphase to anaphase transition and sister chromatids separate. Intriguingly, recent data by our and other groups suggested that prophase pathway signaling and separase’s proteolytic activity also bring about centriole disengagement and, moreover, that Sgo1 is counteracting this licensing step of later centrosome duplication. It was reported that an alternatively spliced isoform of Sgo1 localizes and functions at centrosomes rather than centromeres. Inspired by this initial study, I used stable Hek293 cell lines that inducibly expressed one of various Sgo1 isoforms from siRNAresistant transgenes. This allowed me to deplete all endogenous Sgo1 variants by RNAi and replace them by individual isoforms. Localization studies of various isoforms of Sgo1 identified a peptide encoded by an alternatively spliced exon, which not only directs human Sgo1 to centrosomes but at the same time also abrogates its association with centromeres. This centrosomal targeting signal of human Sgo1 (CTS) is transferrable as it specifically directs mCherry to centrosomes. Mutation of just three consecutive amino acids within the corresponding peptide inactivates both the pro-centrosomal as well as the anti-centromeric targeting effect. Importantly, localization closely correlates with function as revealed by rescue experiments: Whereas centromere-associated isoforms of Sgo1 protect only sister chromatid cohesion, centrosomally bound variants exclusively preserve centriole engagement. The latter function of Sgo1 is dependent on the interaction with PP2A, as centrosome-associated Sgo1 variants with a mutated PP2A binding site are compromised in their ability to support centriole engagement. Premature centriole disengagement caused by Sgo1 depletion was consistently rescued by expression of a fusion protein consisting of the regulatory subunit of PP2A and the CTS. Sgo1 seems to directly counteract the prophase pathway at the centrosomes, analogous to its role at the chromosomes, since artificially abrogating the prophase pathway rescued the Sgo1 knockdown phenotypes. It is known that the final trigger of centriole disengagement is cleavage by separase. Therefore, I checked for removal of remaining cohesin from the centrosomes over time. Cohesin disappeared from the centrosomes only upon activation of separase in anaphase, which correlated with the timing of centriole disengagement in late mitosis. Sgo2, the second vertebrate shugoshin, has an essential cohesin protective function in meiosis but why it is also expressed in mitosis remains largely enigmatic. Although Sgo2 does not contain a CTS, it was observed to also localize to the centrosome. A knockdown/rescue assay revealed that Sgo2, like Sgo1, contributes to the preservation of centriole engagement. Like at meiotic chromosomes, this newly discovered role of Sgo2 at mitotic centrosomes also depends on the recruitment of PP2A. My findings unequivocally demonstrate that Sgo1’s centromeric function to protect cohesin from the prophase pathway by recruiting PP2A is conserved on centrosomes. As the protector of chromatid cohesion and centriole engagement Sgo1 is a key regulator for faithful mitosis.

Abstract in weiterer Sprache

Um die Genomstabilität aufrecht zu erhalten, muss der Chromosomenzyklus mit dem Centrosomenzyklus koordiniert werden. Diese Choreographie wird unter anderem durch die zweifache Verwendung des Multiproteinkomplex Cohesin sowohl beim Zusammenhalt der Schwesterchromatiden als auch bei der Kopplung der Centriolen erreicht. Von den Chromosomenarmen wird Cohesin durch den Prophase-Weg entfernt. An den Centromeren hingegen beschützt Shugoshin 1 (Sgo1) zusammen mit assoziierter Protein Phosphatase 2A (PP2A) Cohesin. Erst am Übergang von Metaphase zu Anaphase wird die Scc1 Untereinheit von Cohesin proteolytisch gespalten wodurch die Schwesterchromatiden endgültig voneinander getrennt werden. Interessanterweise weisen neuste Daten unserer und anderer Gruppen darauf hin, dass Prophase-Weg und proteolytische Aktivität von Separase außerdem die Entkopplung von Centriolen, dem Lizensierungsschritt der späteren Centrosomenduplikation, verursachen und dass Sgo1 dem entgegenwirkt. Eine alternativ gespleißte Isoform von Sgo1 lokalisiert ans Centrosom und nicht ans Centromer und wirkt auch dort. Inspiriert von dieser initialen Studie verwendete ich stabile Hek293 Zelllinien, die induzierbar eine der verschiedenen Sgo1 Isoformen siRNA-resistent exprimierten. Das erlaubte mir, alle endogenen Sgo1 Varianten mit Hilfe von RNAi zu depletieren und durch einzelne Isoformen zu ersetzen. Durch Lokalisationsstudien der Sgo1-Isoformen wurde ein Peptid identifiziert, welches nicht nur centrosomale Rekrutierung vermittelt, sondern zugleich auch die centromerische Lokalisation verhindert. Diese CTS (für centrosomal targeting signal of human Sgo1), die von einem alternativ gespleißten Exon kodiert wird, ist übertragbar, da sie in der Lage ist, mCherry an die Centrosomen zu rekrutieren. Mutation von nur drei aufeinanderfolgenden Aminosäuren innerhalb der CTS inaktiviert sowohl die procentrosomale, als auch die anti-centromerischen Lokalisierungs-Effekt. Wie Rettungsexperimente zeigten, korreliert die Lokalisation der Sgo1 Isoformen direkt mit ihrer Funktion: Die Centromer-assoziierte Sgo1 Isoform beschützt ausschließlich Kohäsion der Schwesterchromatiden, wohingegen centrosomal gebundene Varianten ausschließlich die Kopplung der Centriolen aufrechterhalten. Es zeigte ZUSAMMENFASSUNG ! 10! sich, dass hierfür die Interaktion von Sgo1 mit PP2A essentiell ist, da die Centrosomassoziierten Sgo1-Varianten, deren PP2A-Bindungsstelle mutiert ist, nicht mehr in der Lage sind die Kopplung der Centriolen zu beschützen. Außerdem rettete die Expression eines Fusionsproteins bestehend aus der regulatorischen Untereinheit von PP2A und der CTS die durch Sgo1-Knockdown verursachte vorzeitige Entkopplung der Centriolen. Sgo1 scheint zudem an den Centrosomen, wie auch den Chromosomen, direkt dem Prophase-Weg entgegenzuwirken, da die künstliche Inhibierung des Prophase-Wegs die Sgo1 Knockdown-Phänotypen rettet. Es war bekannt, dass der endgültige Auslöser der Entkopplung der Centriolen die Spaltung durch Separase ist. Daher überprüfte ich die Entfernung von Cohesin von den Centrosomen über die Zeit: Cohesin verschwand von den Centrosomen nur nach Aktivierung von Separase in Anaphase, was mit dem Entkoppeln der Centriolen am Ende der Mitose korreliert. Sgo2, das zweite Shugoshin in Vertebraten, hat eine essentielle Schutzfunktion von Cohesin in Meiose. Es ist allerdings noch unbekannt, weshalb es auch in Mitose exprimiert wird. Obwohl Sgo2 keine CTS trägt, lokalisiert es an die Centrosomen. Ein Knockdown/Rettungs-Versuch zeigte, dass Sgo2, wie Sgo1, zur Erhaltung der Centriolenkopplung beiträgt. Diese neu entdeckte Rolle von Sgo2 ist an mitotischen Centrosomen, wie auch an meiotischen, abhängig von der Rekrutierung von PP2A. Meine Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die centromerische Funktion von Sgo1, Cohesin vor dem Prophase-Weg durch Rekrutierung von PP2A zu schützen, am Centrosom konserviert ist. Als Beschützer von Chromatid-Kohäsion und Centriolenkopplung ist Sgo1 somit ein wichtiger Regulator fehlerfreier Mitose.