Regulation der Aktivität des Anti-Sigmafaktors RsiX aus Bacillus subtilis

Titelangaben

Schäfer, Katharina:
Regulation der Aktivität des Anti-Sigmafaktors RsiX aus Bacillus subtilis.
Bayreuth , 2011
( Dissertation, 2012 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Der Gram-positive Modellorganismus Bacillus subtilis besitzt 17 alternative Sigmafaktoren, von denen 7 zur Gruppe der ECF (extra-cytoplasmic function) -Sigmafaktoren gehören. Einer dieser ECF-Sigmafaktoren, SigX, und sein entsprechender Anti-Sigmafaktor, RsiX, sind Gegenstand dieser Arbeit. Dabei handelt es sich bei RsiX um ein Transmembranprotein, während SigX im Cytoplasma lokalisiert ist und von der N-terminalen RsiX-Domäne von einer Interaktion mit der RNA-Polymerase abgehalten wird. SigW, ein weiterer ECF-Sigmafaktor, und RsiW, der dazugehörende Anti-Sigmafaktor, sind bereits sehr gut untersucht. Aufgrund struktureller Ähnlichkeiten zwischen SigX/RsiX und SigW/RsiW wurde angenommen, dass die Aktivierung des SigX-Regulons in vergleichbarer Weise erfolgt, wie es für das SigW-Regulon aufgrund intensiver Analysen sehr gut untersucht ist. Die in dieser Arbeit verwendete Methode der Transposonmutagenese lieferte entscheidende Hinweise über die Regulation des sigX-rsiX-Operons. Es konnte gezeigt werden, dass das sigX-rsiX-Operon einer Regulation durch den Transkriptionsterminator Rho unterliegt. Damit wurde das erst dritte Beispiel für eine Termination der Transkription durch den Faktor Rho in B. subtilis bekannt. Als wichtiges Element für die faktorabhängige Termination der Transkription gilt das Vorhandensein einer rut-site, der Bindestelle des Faktors Rho in der naszierenden mRNA. In dieser Arbeit wurden verschiedene Analysetechniken angewandt, um mit Hilfe eines GFP-RsiX-Reporters erstmals eine rut-site in B. subtilis zu kartieren. Die hier identifizierte rut-site von rsiX ist am 5´-Ende dieses Gens lokalisiert. Bei diesen Analysen wurde außerdem deutlich, dass es im sigX-rsiX-Operon zu einer faktorabhängigen intragenischen Termination der Transkription kommt, bei welcher nicht nur die Transkription von rsiX, sondern auch die Expression des stromaufwärts liegenden sigX beeinflusst wird. Punktmutationen in der Sequenz für die rut-site von rsiX zerstörten den Einfluss des Faktors Rho auf das sigX-rsiX-Operon, so dass keine Termination der Transkription mehr stattfand und die detektierbare Menge an sigX-rsiX-Transkript deutlich anstieg. Nur so war es möglich, einen rsiX-Knockout zu komplementieren. Messungen der beta-Galaktosidase-Aktivität eines lacZ-Reporters belegten zudem die Funktion von RsiX als Anti-Sigmafaktor von SigX. Der Verlust des Einflusses von Rho auf das sigX-rsiX-Operon aufgrund einer mutierten rut site machte auch immunologische Nachweise des Anti-Sigmafaktors möglich. Infolgedessen konnte der Frage einer möglichen RsiX-Proteolyse nach dem Vorbild der RsiW-Proteolyse nachgegangen werden. Für RsiW wurde bereits gezeigt, dass ein bestimmtes Stress-Signal den Abbau des Anti-Sigmafaktors einleitet. Die Proteolyse von RsiW erfolgt dann nach dem Mechanismus der regulierten intramembranen Proteolyse (RIP) unter der Beteiligung mehrerer Proteasen. Neben der Beteiligung der Protease RasP an der RsiW-Proteolyse konnte hier auch die Beteiligung von RasP an der RsiX-Proteolyse nachgewiesen werden. Gleichzeitig wurde aber ausgeschlossen, dass die Protease PrsW, welche auch an der RsiW-Proteolyse beteiligt ist, in die RsiX-Proteolyse involviert ist. Demnach können die einzelnen Schritte der RsiW-Proteolyse nicht einfach auf die RsiX-Proteolyse übertragen werden, obwohl es sich bei beiden Transmembranproteinen um Anti-Sigmafaktoren ihrer jeweiligen ECF-Sigmafaktoren handelt.

Abstract in weiterer Sprache

The Gram-positive model organism Bacillus subtilis encodes 17 alternative sigma factors. 7 of these sigma factors belong to the group of ECF (extra-cytoplasmic function) sigma factors. The subject of this work is about SigX, one of those ECF sigma factors, and RsiX, its corresponding anti-sigma factor. RsiX is a transmembrane protein, whereas SigX is located in the cytoplasm and is sequestered by the N-terminal part of RsiX from its interaction with RNA-Polymerase. SigW, another ECF sigma factor, and RsiW, its corresponding anti-sigma factor, are already very well investigated. Due to structural similarities between SigX/RsiX and SigW/RsiW it was assumed that the activation of the SigX regulon occurred in a way similar to that of the SigW regulon, which is very well known through intensive studies. The transposon screen used in this study yielded some crucial information about the regulation of the sigX-rsiX operon. It was shown that the sigX-rsiX operon is regulated by the transcriptional termination factor Rho. Including the Rho-dependent regulation of the sigX-rsiX operon there are so far only three processes known to be regulated by the factor Rho in B. subtilis. An important element for the factor-dependent termination of the transcription is the existence of a rut-site, the Rho binding site in the nascent mRNA. In this study a GFP-RsiX reporter was used in several approaches to map a rut-site in B. subtilis for the first time. The rut-site for rsiX is located at the 5´-end of this gene. During those analyses it became evident that a factor-dependent intragenic transcriptional termination exists in the sigX-rsiX operon. In this case not only the transcription of rsiX, but also the expression of the upstream located sigX is influenced by the activity of Rho. Pointmutations in the sequence of the rut-site for rsiX abolished the influence of Rho on the sigX-rsiX operon so that transcriptional termination no longer occurred and the detectable amount of sigX-rsiX transcript considerably increased. In this way it was possible to complement a rsiX knockout. Measurements of the beta-Galactosidase activity of a lacZ reporter showed that RsiX acts as the anti-sigma factor of SigX. The loss of the influence of Rho on the sigX-rsiX operon due to the mutated rut-site enabled us to detect the anti-sigma factor immunologically. Therefore it was possible to analyze similarities between the proteolysis of RsiX and RsiW. For RsiW it has been shown that a certain stress signal triggers degradation of the anti-sigma factor. The proteolysis of RsiW occurs in a mechanism called regulated intramembrane proteolysis (RIP) with the involvement of several proteases. Besides the participation of the protease RasP in the RsiW proteolysis this study also revealed the involvement of RasP in the RsiX proteolysis. Concomitant the results of this study exclude the protease PrsW being involved in RsiX proteolysis, although PrsW acts as site-1 protease in the RsiW proteolysis. Although both, RsiX and RsiW, are transmembrane proteins acting as anti-sigma factors of their respective ECF sigma factors, the mechanism of RsiW proteolysis cannot be simply transferred to RsiX proteolysis.