Charakterisierung der Phosphofructokinase-Genfamilie in Arabidopsis thaliana und Oryza sativa

Titelangaben

Hess, Natalia:
Charakterisierung der Phosphofructokinase-Genfamilie in Arabidopsis thaliana und Oryza sativa.
Bayreuth , 2016 . - X, 156 S.
( Dissertation, 2016 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Sauerstoffmangel ist ein Stressfaktor, der bei Pflanzen zu einer Energiekrise führt. Dieser Stress kann entwicklungsbedingt in pflanzlichen Geweben mit hoher meristematischer Aktivität vorkommen, ist jedoch auch eine Folge von Überflutung. Im Laufe der Evolution entwickelten Pflanzen zahlreiche genetische, metabolische und anatomische Anpassungsmechanismen, die ihnen dabei helfen, Sauerstoffmangel zu ertragen oder sich diesem Stress zu entziehen. Das Wachstum von Adventivwurzeln oder die Ausbildung von Aerenchymen sind zwei Beispiele für morphologische Modifikationen, die die Überflutungstoleranz der Pflanze erhöhen können. Aufgrund des Sauerstoffmangels wird auf zellulärer Ebene die mitochondriale Respiration eingeschränkt, wodurch der ATP-Gehalt drastisch sinkt. Um diese Energiekrise zu bewältigen, wird die Expression von Genen, die für Proteine kodieren, die in die Fermentation involviert sind, induziert. Dazu zählen die Alkoholdehydrogenase und die Pyruvat-Decarboxylase (PDC). Pyrophosphat (PPi) ist ein Nebenprodukt vieler biochemischer Prozesse und wird als alternative Energiequelle bei Sauerstoffmangel angesehen. Die PPi-abhängigen Enzyme benutzen PPi anstatt ATP, um die jeweiligen Moleküle zu phosphorylieren. Mehrere PPi-abhängige Enzyme werden bei Hypoxie in Reis induziert, dazu zählt auch die Pyrophosphate:Fructose-6-Phosphat-Phosphotransferase (PFP). Das Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der PFP in den Modellorganismen Oryza sativa und Arabidopsis thaliana bei Sauerstoffmangel zu untersuchen. Zuerst wurden die Transformation von Reis etabliert und anschließend PFP RNAi-Mutanten in Reis hergestellt. Der Vergleich der Oryza sativa PFP RNAi-Mutanten mit Arabidopsis thaliana PFP-Deletionsmutanten sollte die physiologische Relevanz dieses Proteins für beide Organismen aufzeigen. Zu diesem Zweck wurden bei den Mutanten die Metabolitgehalte, die Überlebensraten bei Überflutung und die PFP/PFK-Aktivitäten bestimmt. Die im Rahmen dieser Arbeit gesammelten Daten weisen darauf hin, dass die PFP in Reis im Gegensatz zu Arabidopsis thaliana eine essentielle Rolle spielen könnte. Darüber hinaus wurde die 6-Phosphofructo-2-Kinase/Fru2,6-Bisphosphatase (PF2K) funktionell analysiert. Dieses Enzym produziert Fructose-2,6-Bisphosphat (Fru2,6BP), einen starken Aktivator der PFP. Die Messung von Metabolitgehalten, PFP-Aktivitäten und dem Überleben bei Überflutung sollte Erkenntnisse über die Relevanz dieses Enzyms bringen. Daneben wurde die Phosphofructokinase (PFK), ein Enzym der Glycolyse, das ATP zum Phosphorylieren von Fructose-6-Phosphat (Fru6P) verwendet, untersucht. Die Expression einiger Arabidopsis thaliana PFKs wird bei Sauerstoffmangel induziert. Das Expressionsmuster dieser PFKs korrespondiert mit der PDC, einem Markergen der Antwort auf Sauerstoffmangel. Mehrere T-DNA-Insertionslinien wurden untersucht, dabei konnte gezeigt werden, dass alle Arabidopsis thaliana PFKs und die PF2K wahrscheinlich nicht zum Überleben der Pflanze bei Sauerstoffmangel beitragen. Der Chloroplast enthält ein komplexes System zur Redox-Regulation. Dabei nutzt er die Reduktionskraft der Photosynthese, um die Disulfid-Brücken von Proteinen zu reduzieren und dadurch die Aktivität dieser Proteine zu modifizieren. In Studien konnte bereits gezeigt werden, dass die PFK-Aktivität bei Chloroplasten von Pisum sativum und Spinacia oleracea durch Licht verringert wurde. Im Verlauf dieser Promotionsarbeit wurden in der PFK5 durch vergleichende Sequenzanalysen und die zielgerichtete Mutagenese von Cysteinen zu Serinen die an der Regulation beteiligten Cysteine identifiziert. Anhand einer Strukturvorhersage der PFK5 konnten die Cysteine in einer flexiblen Windung an der Oberfläche des Proteins lokalisiert werden. Dort sind sie leicht für Redox-regulierende Proteine wie Thioredoxin zugänglich. Darüber hinaus war die PFK5-Aktivität gegenüber dem Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) sensitiv und wurde durch Licht modifiziert.

Abstract in weiterer Sprache

Oxygen deficiency is a severe stress for the plant and results in an energy crisis. Hypoxia can occur naturally in plant tissues with high meristematic activity but may also be a result of flooding. Plants developed numerous genetic, metabolic and anatomical adaptations to escape or endure low oxygen. Adventitious root growth or aerenchyma formation are some examples of anatomical modifications to help the plant survive submergence. On the cellular level, the mitochondrial respiration is inhibited due to the oxygen limitation and ATP content decreases dramatically. To cope with the energetic crisis, the expression of genes coding for proteins involved in fermentation, like the alcohol dehydrogenase and pyruvate decarboxylase (PDC), is induced. During hypoxic stress, Pyrophosphate (PPi) is considered as an alternative energy source to ATP. While it is a byproduct of many biochemical processes, PPi-dependent enzymes use PPi instead of ATP for the phosphorylation of their target molecules. Several of these enzymes are induced during hypoxia in rice including the pyrophosphate-fructose 6-phosphate-1-phosphotransferase (PFP). The aim of this study was to investigate the role of the PFP in the model organisms Arabidopsis thaliana and Oryza sativa under oxygen deficiency. First of all, rice transformation was established and PFP RNAi mutants were created in rice. Comparison of the metabolism of PFP mutants in Arabidopsis thaliana and Oryza sativa should reveal the physiological relevance of the enzyme in these organisms. Therefore, carbohydrate contents and the survival under submergence were examined and PFP/PFK activities were determined. The data suggest that in contrast to Arabidopsis thaliana, the PFP of rice might have an essential role for the viability of the plant. Furthermore, functional analysis of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (PF2K), an enzyme producing fructose-2,6-bisphosphate (Fru2,6BP) was performed. Fru2,6BP is a potent activator of the PFP. The metabolite content, PFP activities and survival rate were assessed in two independent A. thaliana T-DNA deletion mutants under submergence to investigate the role of PFP for the survival of the plants in hypoxic conditions. Additionally, phosphofructokinase (PFK), an enzyme of the glycolysis is phosphorylating fructose-6-phosphate using ATP. Several Arabidopsis thaliana PFKs are induced under oxygen deficiency, showing a similar expression pattern to the PDC, a marker gene of hypoxic stress response. T-DNA insertion lines for Arabidopsis thaliana PFKs were analyzed. It was shown that all Arabidopsis thaliana PFKs and the PF2K probably do not contribute to the fitness of the plant under hypoxia. The chloroplast contains a complex redox regulation system harnessing the reducing power of the photosynthesis in order to modify the activity of many plastidic proteins by reducing their disulfide bridges. Several previous published studies showed that PFK activity in Pisum sativum and Spinacia oleracea chloroplasts was regulated by light. During this PhD project the PFK5 amino acid sequence was analysed. Using site directed mutagenesis and changing cysteines to serines, two cysteines involved in the light-dependent redox regulation of the enzyme were identified. Protein modelling revealed the localization of the cysteines on a flexible loop emerging out of the surface of the PFK5 protein, being easily accessible to redox-regulating proteins such as thioredoxins. Further analysis showed that PFK5 activity was sensitive to the reducing agent Dithiothreitol (DTT) and modulated by light.