Effects of sulfur complexation on intestinal transport and toxicity of metalloids in cell cultures

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Hinrichsen, Sinikka:
Effects of sulfur complexation on intestinal transport and toxicity of metalloids in cell cultures.
Bayreuth , 2016 . - XIV, 95 S.
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Arsenic is a common poison and is classified as human carcinogen. Selenium is an essential nutrient, but is highly toxic when applied in high concentrations. The cytotoxic potential of both metalloids is modified when they form sulfur-containing complexes. For arsenic compounds, only some data existed about the bioavailability and cytotoxicity of methylated thioarsenates. No data existed about inorganic thioarsenates, even though their formation during pre-systemic arsenic metabolism was already proven. For selenium compounds, a reported general higher cytotoxicity of selenosulfate compared to selenite for cancer cell lines led to the claim of replacing selenite by selenosulfate in anti-cancer therapies. In the first two studies of the present thesis, intestinal transport (e.g. bioavailability), cellular retention, and cytotoxicity of thioarsenates were investigated. The cellular retention and the intestinal transport of synthesized standard solutions of methylated and inorganic thioarsenates were compared to those of their non-thiolated analogues by means of a model of the human small intestine (Caco-2 cell monolayer). Analyses with AEC-ICP-MS were conducted to monitor species stability during the transport experiments. Both the transcellular uptake route (by phosphate transporters) and the paracellular uptake route (through the tight junctions) were investigated for each arsenic species. The influence of sulfide on arsenite was investigated concerning the formation of inorganic thioarsenates and an accordingly modified cytotoxicity, quantified by means of MTT assay. The cytotoxic effects of arsenite, arsenate, and inorganic thioarsenates were compared for human hepatocytes (HepG2) and urothelial cells (UROtsa). Concentrations of each arsenic species leading to 50 % cell viability (IC50 values) were calculated. Cellular uptake of the different inorganic arsenic compounds was quantified and linked to their cytotoxicity. As expected, arsenite showed the highest cellular retention and intestinal transport of all tested arsenic compounds. The bioavailability of thioarsenates strongly differed from that of their non-thiolated analogues. For dimethylmonothioarsenate, the highest cellular retention and intestinal transport among all methylated arsenic compounds were measured, which is of special concern as this species is known to possess a considerably higher cytotoxicity than its non-thiolated analogue dimethylarsenate. Only low cellular retention – comparable to that of arsenate - was detected for the inorganic thioarsenates mono- and trithioarsenate, but their intestinal transport was considerably higher than that of arsenate. For trithioarsenate, the intestinal transport was even comparable to that of arsenite. Mono- and trithioarsenate were transported intact through the cell monolayer, but partial intracellular reduction to arsenite could not be excluded. Both cellular retention and intestinal transport was negligibly low for mono- and dimethylarsenate and for monomethylmonothioarsenate. The absence of phosphate increased cellular retention of all arsenic compounds indicating the importance of apical phosphate transporters. No data could be presented to interpret the importance of the paracellular transport route as the cell monolayer was damaged during these experiments. Addition of sulfide to arsenite-containing cell growth medium resulted in immediate formation of inorganic thioarsenates and in reduced cytotoxicity. The order of cytotoxicity of the individually applied inorganic arsenic compounds after 24 h exposure was determined as arsenite > trithioarsenate > monothioarsenate > arsenate and this corresponded to the order of cellular arsenic uptake. Considering arsenite as the original present arsenic substrate for the formation of inorganic thioarsenates, thiolation can be seen as a detoxification process due to decreased intestinal transport and cytotoxicity. In case of dimethylmonothioarsenate, which is known to form from dimethylarsenate, thiolation can be seen as an activation process due to increased intestinal transport and cytotoxicity. In the third study, cytotoxic effects and cellular uptake of selenosulfate and selenite were compared for three different cancer cell lines (HepG2, A375, and T24) to reassess the claim of selenosulfate being generally more cytotoxic than selenite for cancer cells. Experiments in absence and presence of amino acids linked the influence of amino acids with the cytotoxicity of the selenium compounds. Selenosulfate was comparably toxic to the three cell lines (IC50 6.6-7.1 µM) and hardly influenced by incubation time and presence or absence of amino acids. Though, selenite cytotoxicity considerably differed among the three cell lines with the result that selenosulfate was more toxic than selenite for HepG2 cells (IC50 > 15 µM), but similar toxic to and lower toxic than selenite for A375 (IC50 4.7 µM) and T24 cells (IC50 3.5 µM). In contrast to T24 cells, HepG2 cells were “routinely” cultivated with amino acids. Addition of amino acids to T24 cell growth medium led to reduced selenite uptake and toxicity, rendering it less toxic than selenosulfate. The strong effect of amino acids on selenite toxicity for T24 cells could be explained by an inhibition of the x¬c- transport system which facilitates cellular selenium uptake by secretion of cysteine and reduction of selenium compounds. Selenosulfate is less affected by the addition of amino acids as it is already a reduced species. Whether selenosulfate or selenite is more cytotoxic, does not only depend on the selenium species itself, but also on the sensitivity of the used cell line, the supplements of the cell growth medium, and the reductive state of the extracellular environment. The general claim of selenosulfate being more toxic than selenite therefore has to be reconsidered.

Abstract in weiterer Sprache

Arsen ist ein bekannter Giftstoff und für den Menschen als kanzerogen eingestuft. Selen ist ein essentieller Nährstoff, jedoch äußerst toxisch in hoher Konzentration. Die Zytotoxizität beider Halbmetalle ändert sich, wenn sie Komplexe mit Schwefel bilden. Über die Bioverfügbarkeit und Zytotoxizität von methylierten Thioarsenaten gab es bisher nur wenige und über die von anorganischen Thioarsenaten gar keine Daten, obwohl deren Bildung während der präsystemischen Arsen-Metabolisierung bereits bewiesen wurde. Selenosulfat galt generell als zytotoxischer für Krebszellen als Selenit. Daraus entstand der Vorschlag, dass Selenosulfat Selenit in der Krebstherapie ersetzen sollte. In den beiden ersten Studien der vorliegenden Arbeit wurden die intestinale Absorption (d.h. die Bioverfügbarkeit), die zelluläre Retention und die Zytotoxizität von Thioarsenaten untersucht. Mit Hilfe eines Modell für den menschlichen Dünndarm (Caco-2-Zellmodell) wurden die zelluläre Retention und die intestinale Absorption von synthetisierten Standardlösungen von methylierten und anorganischen Thioarsenaten mit denen ihrer nicht-thiolierten Strukturanaloge verglichen. Die Stabilität der einzelnen Verbindungen während der Transportexperimente wurde durch AEC-ICP-MS Analysen beurteilt. Sowohl der transzelluläre Aufnahmeweg (durch Phosphat-Transporter) als auch der parazelluläre Aufnahmeweg (durch die Tight Junctions) wurden für jede Arsen-Verbindung untersucht. Der Einfluss von Schwefel auf Arsenit wurde im Hinblick auf die Bildung von anorganischen Thioarsenaten und die daraus resultierende geänderte Zytotoxizität untersucht (gemessen mit dem MTT Test). Die zytotoxischen Effekte von Arsenit, Arsenat und den anorganischen Thioarsenaten wurden für eine menschliche Leberkrebszelllinie (HepG2) und eine Blasenzelllinie (UROtsa) verglichen. Von jeder Arsen-Verbindung wurde die Konzentration berechnet, die zu einer Reduktion der Zellviabilität um 50 % führte (IC50 Wert). Die zelluläre Aufnahme jeder anorganischen Arsenverbindung wurde quantifiziert und mit ihrer jeweiligen Zytotoxizität in Verbindung gebracht. Die höchste zelluläre Retention und intestinale Absorption wurde erwartungsgemäß für Arsenit gemessen. Die Bioverfügbarkeit von Thioarsenaten unterschied sich deutlich von der ihrer nicht-thiolierten Analoge. Unter allen methylierten Arsenverbindungen wurden die höchste zelluläre Retention und intestinale Absorption für Dimethylmonothioarsenat bestimmt. Dies ist besonders bemerkenswert, denn diese Verbindung besitzt eine deutlich höhere Zytotoxizität als ihr nicht-thioliertes Strukturanalog Dimethylarsenat. Die zelluläre Retention der anorganischen Thioarsenate Mono- und Trithioarsenat war vergleichbar gering mit der von Arsenat. Ihre intestinale Absorption war aber deutlich höher als die von Arsenat, für Trithioarsenat sogar vergleichbar mit der von Arsenit. Mono- und Trithioarsenat wurden intakt durch die Zellschicht transportiert, allerdings konnte eine teilweise intrazelluläre Reduktion zu Arsenit nicht ausgeschlossen werden. Die zelluläre Retention und die intestinale Absorption von Mono- und Dimethylarsenat und von Monomethylmonothioarsenat waren vernachlässigbar gering. In Abwesenheit von Phosphat nahm die zelluläre Retention aller Arsen-Verbindungen zu, was auf die Bedeutung von apikalen Phosphat-Transportern hinweist. Es konnten keine Daten über die Bedeutung des parazellulären Transportweges erhoben werden, weil während dieser Experimente die Zellschicht beschädigt wurde. Sulfid-Zugabe in das Zellkulturmedium, das Arsenit enthielt, führte zur sofortigen Bildung von anorganischen Thioarsenaten und zu reduzierter Zytotoxizität. Die Toxizitäts-Reihenfolge der einzelnen anorganischen Arsenverbindungen nach 24 h Inkubation war Arsenit > Trithio-arsenat > Monothioarsenat > Arsenat. Die gleiche Reihenfolge wurde auch für die zelluläre Aufnahme bestimmt. Unter der Annahme, dass anorganische Thioarsenate direkt aus Arsenit gebildet werden, kann Thiolierung als ein Prozess der Detoxifikation beschrieben werden, da dadurch die intestinale Absorption und die Zytotoxizität reduziert werden. Im Fall von Dimethylmonothioarsenat, das aus Dimethylarsenat gebildet wird, kann Thiolierung allerdings als ein Aktivierungsprozess beschrieben werden, da dadurch die intestinale Absorption und die Zytotoxizität gesteigert wird. In der dritten Studie wurden die zytotoxischen Effekte und die zelluläre Aufnahme von Selenosulfat und Selenit für drei verschiedene Krebszelllinien (HepG2, A375 und T24) verglichen, um die Behauptung zu überprüfen, dass Selenosulfat generell zytotoxischer auf Krebszellen wirkt als Selenit. Experimente mit und ohne Aminosäuren untersuchten deren Einfluss auf die Zytotoxizität der Selenverbindungen. Die Zytotoxizität von Selenosulfat war für alle drei Zelllinien vergleichbar (IC50 6.6-7.1 µM) und größtenteils unbeeinflusst durch die Faktoren Inkubationszeit und Aminosäuren. Allerdings war die Zytotoxizität von Selenit für die drei Zelllinien sehr unterschiedlich, was dazu führte, dass Selenosulfat toxischer als Selenit für HepG2 war (IC50 > 15 µM), aber vergleichbar toxisch mit bzw. weniger toxisch als Selenit für A375 (IC50 4.7 µM) und T24 Zellen (IC50 3.5 µM). Im Gegensatz zu den T24 Zellen wurden die HepG2 Zellen routinemäßig mit Aminosäuren kultiviert. Durch die Zugabe von Aminosäuren zum T24 Zellkulturmedium wurden Selenitaufnahme und -toxizität dermaßen reduziert, dass Selenosulfat für T24 Zellen toxischer war als Selenit. Der starke Einfluss von Aminosäuren auf die Selenit-Toxizität für T24 Zellen könnte durch eine Hemmung des xc-- Transportsystems erklärt werden, welches die zelluläre Selenaufnahme durch Exkretion von Cystein und Reduktion der Selenverbindung steuert. Selenosulfat ist durch die Aminosäuren wenig beeinflusst, da es bereits reduziert ist. Ob Selenosulfat oder Selenit zytotoxischer ist, hängt nicht nur von der Selenverbindung selbst ab, sondern auch von der Empfindlichkeit der verwendeten Zelllinie, den einzelnen Bestandteilen des Zellkulturmediums und den reduktiven Bedingungen in der extrazellulären Umgebung. Die generelle Behauptung, dass Selenosulfat toxischer als Selenit ist, muss deswegen überdacht werden.