Analyse von Condensin-Komplexen in Drosophila melanogaster Charakterisierung der Untereinheit CapG und Identifizierung von Interaktionen

Titelangaben

Herzog, Sabine:
Analyse von Condensin-Komplexen in Drosophila melanogaster Charakterisierung der Untereinheit CapG und Identifizierung von Interaktionen.
Bayreuth , 2012
( Dissertation, 2011 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die akkurate Verteilung der Chromosomen während der Mitose ist essentiell für die genetische Stabilität der Zellen. Der heteropentamere Condensin-Komplex ist hierbei an der Strukturierung der Chromosomen und deren physikalischer Stabilität während der Segregation maßgeblich beteiligt. In höheren Eukaryoten konnten zwei dieser Komplexe (Condensin I und Condensin II) identifiziert werden, die ihrerseits eine distinkte subzelluläre Lokalisation während der Interphase und auch Beladung an das mitotische Chromatin aufweisen. Die beiden Komplexe haben die Structural maintenance of chromosomes (SMC) Untereinheiten SMC2 und SMC4 gemein, während sie sich in den nicht-SMC-Untereinheiten unterscheiden: In Condensin I findet man die Komponenten Chromosome associated protein D2 (CapD2), CapG und CapH und in Condensin II die verwandten Proteine CapD3, CapG2 und CapH2. Während in Vertebraten die Rolle beider Condensin-Komplexe während der Mitose klar etabliert ist, zeichnet sich in Drosophila melanogaster ein anderes Bild ab. Mutanten in den Genen CapH2 und CapD3 zeigen keine mitotischen Phänotypen und ein zu CapG2 homologes Protein konnte bisher nicht identifiziert werden. Da CapG aus Drosophila ein ähnliches Lokalisationsverhalten wie die Condensin II-Untereinheiten der Vertebraten aufweist, wird CapG als Komponente beider Condensin-Komplexe diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Funktion und die Regulation von CapG in Drosophila melanogaster, primär durch die Analyse von EGFP-fusionierten Proteinvarianten, näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von CapG neben den hauptsächlichen Phosphorylierungsstellen auch Kernimportsequenzen enthält, welche die subzelluläre Lokalisation des Proteins während des Zellzyklus regulieren. Während der Interphase zeigt CapG im Zellkern eine Kolokalisation mit dem Heterochromatin-bindenden Protein HP1, was auf eine direkte Chromatinassoziation von CapG hinweist und mögliche Chromatin-strukturierende Funktionen bestätigen würde. Diese Heterochromatin-spezifische Lokalisation kann vom C-terminalen Drittel von Cap-G vermittelt werden, der andererseits für die generelle Chromatinassoziation während der Mitose, die Interaktion mit den anderen Condensin I-Untereinheiten und für die Funktionalität von CapG während der somatischen Mitosen entbehrlich ist. Da ein Proteinfragment entsprechend der N-terminalen Zwei-Drittel von CapG (CapG-NM) während der Interphase hauptsächlich zytoplasmatisch lokalisiert ist, kann die präferentielle Kernlokalisation von CapG während der Interphase, und auch die Phospho-Regulation des Proteins, für die Entwicklung vom Beginn der embryonalen zygotischen Expression bis hin zum adulten Stadium nicht essentiell sein. Die in dieser Arbeit nachgewiesene Lokalisation von CapG und anderen Condensin Untereinheiten in Geweben der weiblichen und männlichen Keimbahn legt die Vermutung nahe, dass CapG, eventuell im Kontext mit den anderen Condensin-Untereinheiten, eine Rolle bei der Gametogenese zukommt. Konsistent hiermit ist die Beobachtung, dass Weibchen steril sind, die in ihren Keimbahnzellen keine funktionelle CapG-Variante exprimieren. Die Integrität der Ovarien in diesen Tieren spricht für eine Funktion von CapG bei der Reifung des Oozytenkerns oder den meiotischen Teilungen. Die Präsenz von CapG in löslichen Komplexen mit den bekannten Condensin I-Untereinheiten konnte in dieser Arbeit durch Koimmunpräzipitationen mit nachfolgender massenspektroskopischer Bestimmung der assoziierten Proteine bestätigt werden. Eine Assoziation mit Condensin II-spezifischen Untereinheiten wurde dagegen nicht gefunden. Ebenso assembliert eine ektopisch exprimierte, funktionelle Variante von CapH2 nicht in einem löslichen Komplex mit CapG. Auch die Analyse direkter Protein-Protein-Interaktionen in einem in vitro-System ergab keine Hinweise auf eine Assoziation von CapG mit Condensin II-spezifischen Untereinheiten. Dagegen konnten in diesem System die Interaktionen nachvollzogen werden, die für Condensin I und Condensin II aus anderen Systemen publiziert und somit erwartet sind. Experimente zur genetischen Interaktion der Condensin-Untereinheiten offenbarten bei Anwesenheit von CapG-Mutationen eine Suppression des Phänotyps, der nach Überexpression von CapH2 in Speicheldrüsen erhalten wird. In einem reziproken Ansatz führten CapG-Mutationen zu einer Verstärkung des CapH2-mutanten Phänotyps in den Nährzellen von Ovarien. CapH2 und CapG scheinen also auf genetischer Ebene miteinander zu interagieren. Zusammengenommen legen die Ergebnisse ein Modell nahe, in dem CapG zwar nicht in direkter Assoziation mit Condensin II-spezifischen Komponenten vorliegt, aber parallel an der Strukturierung von Chromatin beteiligt ist und funktionell zum Teil mit den Aufgaben der Condensin II-spezifischen Komponenten überlappt.

Abstract in weiterer Sprache

The faithful segregation of sister chromatids during mitosis is essential for the inheritance of the genome. Here, the heteropentameric condensin complex is important for a robust structure of the chromosomes and for their accurate segregation during anaphase. Two related complexes, condensin I and condensin II, have been identified in higher eukaryotes. The two complexes exhibit distinct localization patterns during the cell cycle and a distinct association with mitotic chromatin. Both complexes are built on a framework of the two structural maintenance of chromosomes (SMC) subunits SMC2 and SMC4, and a distinct set of non-SMC-subunits: Condensin I contains Chromosome associated protein D2 (CapD2), CapG and CapH, condensin II the related proteins CapD3, CapG2 and CapH2. Whereas for both complexes clear functions could be established during mitosis in vertebrates, the situation in Drosophila melanogaster is ambiguous. In Drosophila, mitosis is undisturbed in the absence of CapH2 or CapD3, and so far no homolog for CapG2 could be identified. However, the localization pattern of CapG is similar to the vertebrate Condensin II specific subunits. Hence it is speculated, that CapG can be part of both condensin complexes of Drosophila melanogaster. In this study, the function and regulation of CapG in Drosophila melanogaster was scrutinized by analyzing a set of EGFP-fused protein variants. It was shown, that the C-terminal part of CapG contains the major phosphorylation sites and also nuclear import sequences, thereby regulating the subcellular localization of CapG during the cell cycle. Furthermore, during interphase, colocalisation of CapG with the heterochromatin binding protein HP1 was shown, which implies a direct chromatin binding of CapG and supports a previously reported role of CapG in the regulation of heterochromatic gene expression. The targeting to heterochromatin is mediated by the C-terminal part of CapG. Surprisingly, this protein fragment is neither essential for chromatin association during mitosis, nor for the interaction with the other condensin I subunits, nor for the function of CapG during the somatic cell divisions in Drosophila embryos. Contrariwise, a protein fragment consisting of the N-terminal two-thirds of CapG (CapG-NM) is able to provide the protein function required for the development from an embryo to an adult fly, after the exhaustion of maternal contribution. Thus, the subcellular localization of CapG during interphase and also its C-terminal phospho-regulation are not essential for protein function during these stages of development. Furthermore, a unique localization of CapG and its condensin I binding partner CapD2 was shown in germline tissues of adult flies, which implies a specific function of condensin I during gametogenesis. Consistent with this notion, females lacking a functional version of CapG during oogenesis are sterile. Nevertheless, ovaries dissected from these females did not show obvious defects, an observation which implies a function of CapG during oocyte maturation or the meiotic divisions. The composition of soluble condensin I complexes was verified by the precipitation of individual components from Drosophila embryo and ovary extracts and subsequent analysis of their interacting proteins via mass spectrometry. In contrast, an interaction of CapG and endogenous condensin II-specific components could not be demonstrated. Furthermore, an ectopically expressed CapH2-variant was not found to associate with CapG. The additional analysis of direct protein-protein interactions using an in vitro assay also did not reveal an interaction between CapG and the condensin II-specific components. Rather the established geometry of the condensin I or condensin II complex components was confirmed in this assay. Nevertheless, genetic interaction assays revealed that the phenotypes obtained after overexpression or mutation of genes encoding condensin II specific components are modified by mutations in CapG. CapH2 and CapD3 can promote the disassembly of polytene structures into chromosomal components in the ovarian nurse cells and also in the salivary glands. In this context, it was shown that the CapH2-overexpression phenotype is suppressed, and the CapH2-mutant phenotype is enhanced, in a CapG heterozygous mutant background. Thus, there is a genetic interaction between CapH2 and CapG in these tissues. Taken together, these results reveal that CapG, even if it is not directly associated within a condensin II complex, contributes to chromatin organization in a manner that partially overlaps with the function of the condensin II-specific subunits.