Identification of substrate proteins of FtsH during sporulation of Bacillus subtilis

Titelangaben

Nguyen, Hue Bach Thi:
Identification of substrate proteins of FtsH during sporulation of Bacillus subtilis.
Bayreuth , 2012
( Dissertation, 2012 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

FtsH is an ATP- and Zn2+-dependent metalloprotease anchored in the cytoplasmic membrane by two transmembrane segments. It is the unique membrane-bound AAA-protease in bacteria that performs a variety of regulatory functions. In B. subtilis, an ftsH knockout exhibits a pleiotropic phenotype such as filamentous growth, sensitivity towards heat, osmotic shock and cells are unable to sporulate. Recently, it has been shown that ftsH knockout cells fail to entry sporulation stage II due to lack of a sufficient amount of Spo0A~P and the first substrate of FtsH identified in B. subtilis is the Spo0E phosphatase, a negative regulator that dephosphorylates Spo0A~P. However, the sporulation frequency in a spo0E ftsH double mutant strain was only partly restored, we hypothesized that FtsH might degrade additional substrate proteins involved in sporulation. To identify these proteins, two different strategies were applied. By using the 2D gel technique, the proteomes of an ftsH wild-type strain was compared with an ftsH null mutant. Several proteins were identified to be either up- or down-regulated in the absence of FtsH. One of them up-regulated about 4-fold was identified as Spo0M. Since ftsH did not interfere with transcription of spo0M, an in vitro proteolysis assay was established using purified components. It was shown that Spo0M was degraded by FtsH in an ATP- and time-dependent way. In the second strategy, an ftsHtrap mutant was constructed and tested for loss of its proteolytic activity. Protease trap mutants are still able to bind substrate proteins, but are unable to degrade them. By using FtsHtrap fused to a GST-tag, YwnF, a membrane protein, was trapped and identified as a substrate of FtsH by mass spectrometry. However, further experiments will be required to confirm YwnF as a target of FtsH. The last part of this thesis was focused on the eag gene, which forms a bicistronic operon with Spo0E. Construction and analysis of an eag insertion mutant exhibited a slight increase in the sporulation frequency and in the amount of Spo0A. A transcriptional fusion between the promoter of the spo0E-eag operon and the lacZ reporter gene revealed an increase in the beta-galactosidase activity from t0 when the cells were grown in sporulation medium. Since the Eag protein may be an integral membrane protein, it may bind excess Spo0E thereby preventing it from dephosphorylating Spo0A~P. Alternatively, Eag may bind Spo0E and present it as a modulator to FtsH for degradation.

Abstract in weiterer Sprache

FtsH ist eine ATP- und Zn2+-abhängige Metalloprotease, welche mittels zweier Transmembran-Segmente in der cytoplasmatischen Membran verankert ist. Sie ist die einzige beschriebene Membran-verankerte AAA-Protease bei Bakterien mit verschiedenen regulatorische Funktionen. Eine ftsH-Knockout Mutante zeigt einen pleiotropen Phänotyp. Dazu gehören filamentöses Wachstum der Zellen, Sensitivität gegenüber einem Hitzeschock und osmotischen Schock, und die Zellen können nicht mehr sporulieren. Kürzlich konnten wir zeigen, dass ftsH-Knockout Zellen nicht das Sporulations-Stadium II erreichen aufgrund einer zu geringen Menge an Spo0A~P. Außerdem haben wir Spo0E, eine Spo0A~P-spezifische Phosphatase, als erstes Substrat von FtsH identifiziert. Da die Sporulationsfrequenz in einer spo0E ftsH Doppelmutante nur teilweise wiederhergestellt wird, vermuten wir, dass FtsH weitere Substratproteine abbaut, die die Sporulation negativ beeinflussen. Um weitere Proteine zu identifizieren, wurden zwei verschiedene Strategien angewendet. Mittels der 2D-Gel Technik wurden die Proteome einer ftsH Wildtyp- und einer ftsH-Knockout-Mutante miteinander verglichen. Es konnten eine Reihe von Proteinen identifiziert werden, die in Abwesenheit von FtsH entweder vermehrt oder reduziert produziert wurden. Eines der mengenmäßig etwa 4-fach erhöhten Proteine wurde als Spo0M identifiziert. Da ftsH nicht mit der Transkription von spo0M interferiert, wurde ein in-vitro-Proteolysetest mit gereinigten Komponenten etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass Spo0M ATP- und Zeit-abhängig von FtsH abgebaut wird. In der zweiten Strategie wurde zunächst eine ftsHtrap Mutante konstruiert und auf Verlust der Proteolyse-Aktivität getestet. Protease Trap-Mutanten sind noch in der Lage ihre Substrate zu binden, können diese aber nicht mehr abbauen. Mit Hilfe einer GST- ftsHtrap Mutante konnte das Membran-Protein YwnF gebunden und dann mittels Massen-Spektrometrie identifiziert werden. Weitere Experimente sind notwendig, um YwnF als Substrat-Protein zu verifizieren. Der letzte Teil der Dissertation galt dem eag-Gen, welches mit spo0E ein bicistronisches Operon bildet. Die Konstruktion und Analyse einer eag Insertions-Mutante ergab einen leichten Anstieg in der Sporulationsfrequenz und in der Menge an Spo0A. Eine Transkriptionsfusion zwischen dem Promotor des spo0E-eag Operons und dem lacZ Reportergen zeigte einen Anstieg in der beta-Galactosidase Aktivität ab t0 bei Wachstum der Zellen in Sporulationsmedium. Da es sich bei Eag vermutlich um ein integrales Membranprotein handelt, kann es überschüssige Mengen an Spo0E binden und dadurch eine Dephosphorylierung von Spo0A~P verhindern. Alternativ oder zusätzlich kann Eag Spo0E binden und es FtsH als Modulatorprotein zum Abbau präsentieren