Charakterisierung und Funktionalisierung von Filmen aus rekombinanten Spinnenseidenproteinen

Titelangaben

Spieß, Kristina:
Charakterisierung und Funktionalisierung von Filmen aus rekombinanten Spinnenseidenproteinen.
Bayreuth , 2012
( Dissertation, 2012 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Spinnenseide stellt aufgrund ihrer mechanischen und chemischen Eigenschaften ein faszinierendes Protein-basiertes Material mit Potential für vielfältige Anwendung in technischen und biomedizinischen Bereichen dar. Rekombinant hergestellte Spinnenseidenproteine können neben der natürlichen Assemblierungsform des Fadens zu diversen Morphologien, wie Vliesen, Mikropartikeln, Kapseln oder Filmen verarbeitet werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Filme aus dem rekombinant produzierten Protein eADF4(C16) umfassend charakterisiert. eADF4(C16)leitet sich von der repetitiven Kerndomäne des Proteins ADF4 ab, welches ein Hauptbestandteil der sog. dragline Seide der Europäischen Gartenkreuzspinne Araneus diadematus ist. Der Einfluss verschiedener Prozessparameter auf bestimmte Eigenschaften des resultierenden Films wurde systematisch untersucht. Die Variablen umfassten dabei die Wahl des Lösungsmittels zum Gießen des Films (Hexafluoroisopropanol, Ameinsensäure sowie ein wässriger Puffer), die Art der Nachbehandlung (Methanol bzw. Ethanol sowie Kaliumphosphatlösung), sowie die relative Luftfeuchtigkeit. Alle Parameter zeigten dabei einen Einfluss auf die Sekundärstruktur der Proteine im Film. Zusätzlich wurden die thermische, chemische und mechanische Stabilität der Filme sowie ihre Oberflächeneigenschaften analysiert. Während sich alle untersuchten Filme kaum in ihrer thermischen Stabilität unterschieden, zeigte sich ein deutlicher Einfluss des verwendeten Lösungsmittels und der Nachbehandlung auf das mechanische Verhalten der Filme unter linearer Zugbelastung. Chemische und mechanische Eigenschaften konnten mit der Sekundärstruktur-Zusammensetzung korreliert werden. Aus Zugversuchen, DMA sowie einer Kombination aus linearer Zugbelastung und gleichzeitiger FTIR-Analyse konnte geschlossen werden, dass das verwendete Lösungsmittel nicht nur die Zusammensetzung der Sekundärstruktur beeinflusst, sondern auch die Vernetzung/Anordnung der einzelnen Strukturelemente. Dieser Einfluss überdauerte auch die Nachbehandlung der Filme. Alle untersuchten Nachbehandlungsarten führten zu einer Erhöhung des beta-Faltblattanteils. Allerdings konnte ein Effekt der gewählten Methode auf die Oberflächenbeschaffenheit der nachbehandelten Filme festgestellt werden: Die jeweiligen Filme unterschieden sich sowohl in ihrer Topographie als auch in ihrer Hydrophobizität. Für viele Anwendungen sind zusätzliche Funktionalisierungen vorteilhaft. Hierfür wurde die Methode der post-translationalen chemischen Kopplung gewählt.Um eine chemisch spezifische Reaktionsstelle bereitzustellen, wurden Cystein-Mutanten des Proteins eADF4(C16) hergestellt. Drei verschiedene Proteinvarianten wurden gereinigt und charakterisiert. Die Untersuchung ihrer Sekundärstruktur in Lösung und in assemblierten Filmen ergab keine signifikanten Änderungen im Vergleich zu dem Cystein-freien eADF4(C16). Zusätzlich konnten die Proteine sowohl in Lösung als auch nach Filmbildung in einer spezifischen Reaktion mit hoher Effizienz modifiziert werden. Um die Variabilität der Funktionalisierung zu zeigen, wurde die kovalente Kopplung von Fluorescein, Biotin und Nanogold durchgeführt. Des Weiteren konnte das Enzym Galaktosidase unter Beibehaltung seiner Aktivität immobilisiert werden. Für spätere Zellkulturanalysen wurde zudem eine RGD-Sequenz in Form eines zyklischen Peptids gekoppelt, die eine Integrin-vermittelte Zelladhäsion ermöglicht. Im Hinblick auf potentielle Anwendungen der rekombinanten Spinnenseidenfilme als Beschichtung wurden die Oberflächeneigenschaften der jeweiligen Filme analysiert. Dabei zeigte sich, dass besonders die Benetzbarkeit bzw. Hydrophobizität der Filmoberfläche in Abhängigkeit des verwendeten Substrats variierte. Auf hydrophoben Materialien (Polystyrol und Teflon) wiesen dünne Filme eine hydrophile Oberfläche auf, während Filme auf Glas hydrophobe Eigenschaften zeigten. Gleichzeitig konnten Unterschiede in der Sekundärstruktur der Filme nachgewiesen werden. In Anlehnung an Theorien für Block-Copolymere wurde ein Modell über eine mögliche Anordnung der Strukturelemente in diesen Filmen aufgestellt, um die beobachteten Oberflächeneffekte zu erklären. Natürliche Seidenmaterialien stellen aufgrund ihrer guten Biokompatibilität und ihrer biologischen Abbaubarkeit auch interessante Kandidaten für biomedizinische Applikationen dar. Daher wurde die biologische Verträglichkeit der rekombinanten Spinnenseidenfilme in vitro untersucht. Erste Ergebnisse ergaben eine gute Verträglichkeit des Materials; so adhärierten Prä-Osteoblasten (MC3T3-E1) auf den Filmen und konnten über mehrere Tage kultiviert werden. Das verwendete Lösungsmittel und die Nachbehandlungsart beeinflussten signifikant das Resultat, was möglicherweise auf die unterschiedliche Oberflächenchemie und -topographie zurückzuführen ist. Während die Adhäsion der Zellen auf nicht-modifizierten Filmen schwach war, konnte diese durch Kopplung der spezifischen Zelladhäsions-Sequenz c(RGDfK)verbessert werden.

Abstract in weiterer Sprache

Due to their extraordinary mechanical and biochemical properties, spider silks represent fascinating protein-based materials which are promising candidates for versatile biomedical and technical applications. In vivo, fibers are formed from silk proteins. In vitro, however, recombinantly produced spider silk proteins can be assembled into different morphologies, including particles, capsules, non-wovens or films. Here, films made of the recombinant spider silk protein eADF4(C16), which is based on the sequence of the repetitive core domain of the dragline silk protein ADF4 of the European garden spider Araneus diadematus, are characterized. The influence of different processing parameters including the initial solvent of the protein (hexafluoroisopropanol, formic acid and aqueous solution), the used post-treatment method (methanol and ethanol as well as potassium phosphate) and relative humidity on distinct film properties are systematically studied. While all tested parameters influenced the secondary structure of the proteins within the films, they had no remarkable effect on the films’ thermal stability, as determined by DSC and TGA measurements. In contrast, chemical stability and mechanical characteristics revealed a clear dependence on the initial solvent and post-treatment, and could be correlated with the secondary structure content in the film. Tensile testing, dynamic mechanical analysis, as well as combined polarized IR spectroscopy and mechanical analysis indicated an influence of the initial solvent not only on the presence but also on the arrangement of secondary structure elements, with the effect being sustained even after methanol treatment. Analysis of surface characteristics of the different films revealed an influence of the tested post-treatment procedures on the films topography and hydrophobicity. In contrast, the initial solvent only showed minor effects, except for the aqueous system. For many applications specific functionalization with external effector molecules is necessary or beneficial. Therefore, post-translational chemical coupling was chosen. In order to provide a reaction site for specific and controlled functionalization, cysteine containing variants of eADF4(C16) were produced. Three different cysteine variants, containing a single cysteine each, were characterized in terms of secondary structure, assembly and chemical reactivity in solution. Their structural characteristics were comparable to the original cysteine-free protein both in solution and in assembled films. Further, the proteins in solution as well as in cast films could be easily modified. Chemical coupling with molecules like nanogold, fluorescein, biotin or beta-galactosidase demonstrates the possible site-selective functionalization of silk films. Additionally, a cyclic RGD-peptide was added to the films in order to enable integrin-mediated cell adhesion in subsequent biocompatibility tests. With respect to potential future applications of the spider silk films, different technically important hydrophobic (polystyrene and Teflon) and hydrophilic (glass) substrates were coated with eADF4(C16). As critical parameters, surface properties like topography and wettability were analyzed. It was shown that especially the wettability of thin silk films depended on the chosen substrate, with intrinsically hydrophobic substrates revealing a hydrophilic film surface and vice versa. Additionally, changes in the secondary structure of the proteins were observed in these different films. Therefrom, a model concerning the arrangement of the proteins/protein motifs within the film was derived, according to basic principles of block-copolymer chemistry. Due to the biocompatibility of natural silks, silk materials are interesting candidates for use in medical applications. Therefore, the biocompatibility of eADF4(C16) films was investigated. Pre-osteoblasts (MC3T3-E1) could be cultured on the silk films for several days revealing no adverse effects. The initial solvent used for film preparation and the used post-treatment method influenced cell behavior, which can probably be attributed to differences in surface chemistry and topography of the respective films. However, adhesion of the cells on non-modified films seemed to be weak, which could be improved by coupling of the cyclic RGD-peptide c(RGDfK) to the films. Overall, this work provides information about how distinct properties of recombinant spider silk films may be influenced and controlled by varying processing parameters. The results reveal insights into the structure-function-relationship of silk proteins in such films, which provides basic knowledge for future investigations directed to specific applications thereof. The possibility of versatile functionalizations in combination with their general biocompatibility indicates a high potential for several applications of films made of recombinant spider silk proteins in technical as well as biomedical fields.