Untersuchung des Beitrags von Nicotianaminsynthase zur Zinkhyperakkumulation in Arabidopsis halleri

Titelangaben

Deinlein, Ulrich:
Untersuchung des Beitrags von Nicotianaminsynthase zur Zinkhyperakkumulation in Arabidopsis halleri.
Bayreuth , 2012
( Dissertation, 2012 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Zinkdefizienz gehört zu den am meisten verbreiteten Nährstoffmangelerkrankungen weltweit (White and Broadley, 2009). Die Züchtung von zinkreicheren Anbaupflanzen könnte durch ein besseres Verständnis der Mechanismen pflanzlicher Zinkhyperakkumulation erleichtert werden. Hyperakkumulierer sind dazu in der Lage, mehr als hundertmal mehr Zink in den Blättern anzureichern als normale Pflanzen. In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass Nicotianaminsynthase 2 (NAS2) in den Wurzeln der zinkhyperakkumulierenden und -hypertoleranten Pflanze Arabidopsis halleri um ein Vielfaches stärker exprimiert ist, als im Nicht-Hyperakkumulierer Arabidopsis thaliana (Weber et al., 2004; Weber et al., 2006). Diese Tatsache machte NAS2 zu einem wichtigen Kandidatengen für die Zn-Hyperakkumulation, wobei es aufgrund von Ergebnissen aus Hefevorexperimenten auch zu einem Kandidatengen für die Zn-Hypertoleranz wurde (Weber et al., 2004). NAS2 katalysiert die Bildung des Metallchelators Nicotianamin (NA) aus drei Molekülen S-Adenosyl-Methionin (SAM) (von Wiren et al., 1999). Die Kernaufgabe dieser Dissertation war, einen potentiellen Zusammenhang zwischen der in A. halleri erhöhten NAS2-Expression und der Hyperakkumulation von Zink zu untersuchen. Dafür wurden A. halleri Populationen von metallkontaminierten und von unbelasteten Standorten sowie AhNAS2 RNAi-Linien untersucht und charakterisiert. Sowohl die AhNAS2-Transkritniveaus als auch die Nicotianamingehalte waren in den Wurzeln aller getesteten Individuen der verschiedenen Arabidopsis halleri Populationen signifikant höher als in Arabidopsis thaliana. Des Weiteren konnte in den Experimenten mit AhNAS2 RNAi-Pflanzen gezeigt werden, dass diese erhöhte AhNAS2-Expression und daraus resultierende höhere NA-Gehalte in den Wurzeln zur Hyperakkumulation von Zink beitragen. In Linien mit starkem AhNAS2 RNAi-Effekt wurden im Vergleich zum Wildtyp signifikant höhere Zinkkonzentrationen in den Wurzeln gemessen, wobei im Spross das Gegenteil der Fall war. Das Verhältnis von Sprosszinkgehalt zu Wurzelzinkgehalt ist in einer hyperakkumulierenden Pflanze größer als 1 und lag in der vorliegenden Arbeit in Wildtyppflanzen und Kontroll-RNAi-Linien jeweils über dem Wert 15. In den starken RNAi-Linien konnte dieser Wert einzig durch die Herunterregulierung der AhNAS2-Transkriptmengen unter 4 gesenkt werden. Dieses Ergebnis untermauert die Hypothese, dass Nicotianamin eine wichtige Rolle in der Zinkhyperakkumulation in A. halleri spielt. In Zinklokalisierungsexperimenten mit dem fluoreszenten Farbstoff Zinpyr-1 konnten die in den ICP-OES-Analysen erhaltenen Unterschiede zwischen Wurzelzinkgehalt im Wildtyp und der starken Linie 1-2 mit einem konfokalen Lasermikroskop bestätigt werden. Die höheren Zinkgehalte im Sprossgewebe des Wildtyps waren sowohl im hydroponischen Wachstumsmedium als auch in Experimenten mit artifiziell kontaminierter Erde und unter fast natürlichen Bedingungen mit kontaminierter Erde von nativen A. halleri Standorten im Harz konsistent. Analysen zur Speziierung und Zinkverteilung zeigten, dass in den Wurzeln von A. halleri Zink-Nicotianamin-Komplexe gebildet werden, welche die Xylembeladung erleichtern. Diese Entdeckung besitzt hohe Relevanz für die Entwicklung von Biofortifikationsanwendungen. In Toleranzexperimenten konnte gezeigt werden, dass Cadmiumkonzentrationen bis 2 µM im hydroponischen Wachstumsmedium keine toxischen Effekte, weder auf A. halleri Wildtyp- noch auf AhNAS2 RNAi-Pflanzen hatten. Im Gegensatz dazu bildeten alle getesteten Linien nach Zugabe von 10 µM Cd2+ bzw. 5 µM Ni2+ zum Medium starke Chlorosen aus. Die Wurzellängen der getesteten Linien unterschieden sich nach Cadmiumzugabe nicht, während das Wurzellängenwachstum in Gegenwart von zusätzlichem Ni2+ in den starken RNAi-Linien verglichen mit dem Wildtyp signifikant reduziert war. Unter den getesteten Konzentrationen zeigte sich somit die Verbindung von NA zur Nickeltoleranz, nicht jedoch zur Cadmiumtoleranz. Des Weiteren wurden hydroponische Toxizitätsexperimente mit einer externen Zinkkonzentration von 300 µM durchgeführt. Im Vergleich zu den Kontrollbedingungen führte dieser erhebliche Zinküberschuss zu einem deutlich verbesserten Sprosswachstum aller Pflanzen, wobei keine der getesteten Linien Toxizitätssymptome aufwies. In Microarrayanalysen konnte gezeigt werden, dass die Reduktion der NA-Gehalte in A. halleri Wurzeln keine Sekundäreffekte auf andere Metallhomöostasegene zur Folge hat. Nur wenige Gene waren verglichen mit dem Wildtyp in der starken RNAi-Linie induziert, wobei ein für ein “defensin-like protein“ codierendes und eines, welches für die Bildung eines “dual specificity protein“ verantwortlich ist, sowohl unter Kontrollbedingungen als auch nach Zinkbehandlung mindestens vierfach hochreguliert waren. Zusammenfassend kann angemerkt werden, dass mit NAS2 der zweite wichtige Zinkhyperakkumulationsfaktor neben HMA4 (Hanikenne et al., 2008) identifiziert werden konnte.

Abstract in weiterer Sprache

Zinc deficiency is one of the most widespread nutrient deficiencies worldwide (White and Broadley, 2009). A better understanding of the mechanisms underlying zinc hyperaccumulation in plants may facilitate breeding of crop plants with higher zinc contents. Compared with normal plants, hyperaccumulators are able to accumulate over 100-fold higher amounts of zinc in leaves. Preliminary work showed, that nicotianamine synthase 2 (NAS2) expression levels are much higher in roots of the zinc hyperaccumulating and hypertolerant plant Arabidopsis halleri compared to the non-hyperaccumulator Arabidopsis thaliana (Weber et al., 2004; Weber et al., 2006). Because of that NAS2 has become a candidate gene for zinc hyperaccumulation. Based on the results of preliminary yeast experiments it is also a candidate gene for the conferment of zinc hypertolerance (Weber et al., 2004). NAS2 catalyzes the formation of the metal chelator nicotianamine (NA) from three molecules S-adenosyl-methionine (SAM) (von Wiren et al., 1999). The main task of this dissertation was the investigation of a putative connection between elevated NAS2 transcript levels and zinc hyperaccumulation in A. halleri. Therefore different A. halleri populations from either metal contaminated or non-contaminated sites as well as AhNAS2 RNAi lines were analyzed and characterized. Both the AhNAS2 transcript levels and the NA contents were significantly higher in the roots of all tested Arabidopsis halleri populations compared with Arabidopsis thaliana. Experiments with AhNAS2 RNAi plants showed that this upregulation of the AhNAS2 expression and the subsequent higher NA contents in roots contribute to hyperaccumulation of zinc in the aerial plant tissues. Compared to wildtype plants significantly higher zinc values were measured in roots of lines with strong AhNAS2 RNAi effect whereas in leaves the opposite pattern was observed. The shoot/root ratio of zinc concentrations in a hyperaccumulating plant is normally above unity. In this work these values were higher than 15 in the control lines and could be reduced to below 4 in the strong RNAi lines only by suppressing the AhNAS2 expression. This result strongly supports the hypothesis that NA plays an important role in zinc hyperaccumulation of A. halleri. The differences in root zinc content between wildtype and the strong RNAi line 1-2 measured with ICP-OES could be confirmed via zinc localization experiments using the fluorescent dye zinpyr-1. Higher zinc contents in leaf tissue of wildtype A. halleri were consistent both in plants grown in hydroponic medium and on artificially contaminated respectively native soil. This shows that the hyperaccumulation phenotype of strong AhNAS2 RNAi lines is also existent under almost natural conditions. Analysis of zinc speciation and distribution showed that Zn2+-NA complexes are formed in the roots of A. halleri facilitating the xylem loading with zinc. This finding is highly relevant for the development of biofortification approaches. In tolerance studies it could be shown that a cadmium concentration of 2 µM in hydroponic medium does not cause any toxic effects neither on A. halleri wildtype nor on AhNAS2 RNAi plants. In contrast all tested lines showed strong chlorosis after growing with 10 µM Cd2+ or 5 µM Ni2+ respectively. The root lengths did not differ between lines after cadmium treatment whereas the roots of strong RNAi lines were significantly shorter than those of control lines after growing under excess Ni2+. Therefore a connection between NA content and Ni2+ tolerance but no link to cadmium tolerance could be shown under the tested conditions. Furthermore hydroponic toxicity experiments with an external zinc concentration of 300 µM were performed. In comparison to control conditions this high zinc excess lead to an improved shoot growth of all lines without any toxicity symptoms. Microarray analysis proved that the knock down of AhNAS2 and the concomitant reduced NA contents in roots did not cause any secondary effects on the transcriptional basis. None of the known metal homeostasis genes were significantly changed in expression and only very few genes showed different transcript levels at all. Genes coding for a defensin like protein and a dual specificity protein were significantly induced in the strong RNAi line both under control conditions and in the presence of 10 µM Zn2+. In can be summarized, that with NAS2 the second important factor for zinc hyperaccumulation has been identified, besides HMA4 (Hanikenne et al., 2008).