Kombination von Substratanreicherung und Katalyse als generelles Prinzip von Faltungshelferenzymen

Titelangaben

Geitner, Anne-Juliane:
Kombination von Substratanreicherung und Katalyse als generelles Prinzip von Faltungshelferenzymen.
Bayreuth , 2012
( Dissertation, 2012 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

In der Zelle existieren eine Vielzahl von Faltungshelferenzymen: molekulare Chaperone, die durch Bindung an aggregationssensitive Oberflächen die Konzentration aggregationssensitiver Intermediate herabsetzen und Peptidylprolylisomerasen und Thioldisulfidoxidoreduktasen, die geschwindigkeitsbestimmende Schritte während der Proteinfaltung katalysieren. Viele Faltungshelferenzyme kombinieren katalytische Funktion und Chaperonfunktion, die häufig innerhalb verschiedener Domänen lokalisiert sind. Ein solches Beispiel ist die Peptidylprolylisomerase SlpA, die aus einer FKBP-Domäne und einer Chaperondomäne aufgebaut ist. Die FKBP-Domäne besitzt Prolylisomeraseaktivität, die IF-Domäne ist für die Chaperoneigenschaften von SlpA verantwortlich. SlpA besitzt eine sehr geringe Prolylisomerase- und Faltungshelferaktivität, ist jedoch ein äußerst effizientes Chaperon. Die NMR-Struktur von SlpA und ein Vergleich mit der Struktur der homologen Prolylisomerase SlyD liefert keine Erklärung für die sehr geringe Prolylisomeraseaktivität. Die Untersuchung von homologen SlpA-Proteinen aus verschiedenen anderen Organismen zeigt, dass die niedrige Prolylisomeraseaktivität und die hohe Chaperonaktivität in der Familie der SlpA Proteine konserviert sind. SlpA bindet mit hoher Affinität und sehr hoher Dynamik an permanent entfaltete RNaseT1. Die geringe Faltungshelferaktivität von SlpA ist also auf die geringe Prolylisomeraseaktivität der FKBP-Domäne zurückzuführen, und nicht auf eine gestörte Substratbindung oder Dynamik der IF-Domäne. Die Konstruktion einer Chimäre aus der FKBP-Domäne von SlyD und der IF-Domäne von SlpA bestätigt dies. Da in diesem chimären Protein die effiziente Prolylisomerasedomäne von SlyD vorhanden ist, ist es ein hochaktiver Faltungshelfer. SlpA gehört zu den Zwei-Domänen-Proteinen, bei denen eine Domäne (IF) in die Schleife einer anderen Domäne (FKBP) insertiert ist. Stabilitätsuntersuchungen zeigen, dass die IF Domäne in isolierter Form gefaltet vorliegt. Innerhalb des Gesamtproteins stabilisiert die Insertion der IF-Domäne die FKBP-Domäne. Die Faltung der IF-Domäne ist sehr schnell und läuft zum größten Teil autonom von der FKBP-Domäne ab. Bei höheren Konzentrationen an Denaturierungsmittel ist die Stabilität der IF-Domäne nicht mehr ausreichend um selbstständig zu falten. Daher wird sie von der FKBP-Domäne abhängig und beide Domänen bilden eine Faltungseinheit. Die FKBP-Domäne wird nicht nur durch die IF Domäne stabilisiert, sondern stabilisiert auch ihrerseits die IF-Domäne. Die Analyse der Stabilität und der Faltung der SlyD-SlpA-Chimäre zeigt ebenfalls, dass die SlpA-IF-Domäne einen enormen stabilisierenden Einfluss auf die Wirtsdomäne, in dem Fall die SlyD FKBP Domäne, besitzt. Damit unterscheiden sich SlpA und SlyD aufgrund der unterschiedlichen Stabilitäten ihrer IF-Domänen grundlegend in ihren Faltungsmechanismen. Um solche modular aufgebauten Faltungsenzyme genauer zu untersuchen, wurden artifizielle Proteine konstruiert, bei denen nicht-homologe Chaperondomänen, die apikale Domäne aus GroEL aus E. coli, die b'-Domäne der PDI aus S. cerevisiae und die Chaperondomäne des periplamatischen Faltungshelfers SurA aus E. coli in die Prolylisomerase hFKBP12 insertiert wurden. Die Insertion dieser Domänen in eine Schleife von hFKBP12 wirkt stark destabilisierend, da durch den Einbau die lokalen Kontakte der Schleife zerstört werden. Durch das Einführen natürlich vorkommender Linkerbereiche und ihre schrittweise Verlängerung konnte die Wirtsdomäne hFKBP12 stabilisiert werden und ihre Prolylisomeraseaktivität, die durch die Destabilisierung stark beeinträchtigt war, wiederhergestellt werden. Auch durch das Einführen einer Disulfidbrücke im Linkerbereich konnten sowohl hFKBP12 als auch die Gastdomänen enorm stabilisiert werden konnten. Die Anwesenheit der Chaperondomänen steigert in allen Fällen die Faltungshelferaktivität von hFKBP12 und verringert die hohe Substratspezifität der Prolylisomerase gegenüber Proteinsubstraten. Demzufolge ist dies ein generischer Effekt, der unabhängig ist von der Herkunft der Chaperondomäne. Die chimären Faltungshelferenzyme binden mit hoher Affinität und hoher Dynamik an entfaltete Proteinsubstrate. Neben seiner Chaperondomäne besitzt SurA zwei Parvulindomänen, von denen nur eine als Prolylisomerase aktiv ist. Durch den Einbau der IF-Domäne von SlyD als Chaperondomäne in die beiden Parvulindomänen sind die chimären Parvulinkonstrukte in der Lage, entfaltete Protein zu binden und als Chaperon zu wirken. Die Faltungshelferaktivität der katalytisch aktiven Parvulindomäne konnte durch den Einbau der IF-Domäne enorm gesteigert werden. Diesre Arbeit zeigt, dass separate Bindungsstellen für generische Substratbindung und spezifische Katalyse Voraussetzung sind für die Konstruktion von aktiven, artifiziellen Faltungsenzymen aus nicht-verwandten Domänen.

Abstract in weiterer Sprache

A wide variety of folding helper enzymes is present in the cell. Molecular chaperones bind to aggregation sensitive surfaces and thus decrease the concentration of aggregation prone folding intermediates and peptidyl prolyl isomerases and thiol-disulfide oxido reductaces accelerate rate limiting steps in protein folding. Binding of unfolded or partially folded substrates and the catalysis of slow folding steps are often mediated by dedicated domains of folding helper enzymes. The prolyl isomerase SlpA from E. coli shows such a construction principle. It consists of a FKBP domain, that harbors the prolyl isomerase site and the IF domain that is responsible for the chaperone properties of SlpA. SlpA is an excellent chaperone but a poor prolyl isomerase and folding helper. The NMR structures of SlyD and SlpA provide no obvious explanation for the poor folding helper activity of SlpA. The comparison of homologous SlpA proteins from different organisms indicates that the weak prolyl isomerase and folding activity and the good chaperone properties are a conserved feature of the SlpA family. In the affinity and dynamics of substrate binding to its chaperone domain, SlpA resembles other folding enzymes like trigger factor and SlyD. The combination of the active FKBP domain of SlyD and the IF domain of SlpA yielded a highly active folding catalyst. Accordingly, the low folding helper activity of SlpA originates from its very low prolyl isomerase activity and not from an impaired function of the chaperone (IF) domain. SlpA is a two domain protein, in which the IF domain is inserted internally as a guest into a loop of the host domain FKBP. While the IF domain of SlpA is stable in isolated form, the isolated IF domain of SlyD is unfolded. As a consequence the unstable IF domain of SlyD destabilizes its FKBP domain whereas the SlpA IF domain strongly stabilizes the SlpA FKBP domain. In a chimeric form of SlyD that hosts the SlpA IF domain the stability of the FKBP domain is in fact increased as well. Refolding of the SlpA IF domain is very fast and independent of the FKBP domain. At higher denaturant concentrations, when the IF domain loses stability, it becomes dependent on the FKBP domain and both domains form a common folding unit. The unfolding of the IF domain is decelerated by the presence of the folded FKBP domain because it stabilizes the IF domain in its folded form. In SlpA both domains stabilize each other and accordingly the folding mechanisms of SlpA and its homolog SlyD strongly differ from each other. To improve the understanding of the mechanism of folding helper enzymes consisting of different domains, artifical enzymes were created by insertion of non-homologous domains into the prolyl isomerase hFKBP12. The apical domain of the chaperonin GroEL from E. coli, the chaperone domain of protein disulfide isomerase from S. cerevisiae and the chaperone domain of SurA from the periplasm of E. coli served as unrelated chaperone domains. The insertion of the chaperone domains into the loop of hFKBP12 is intrinsically destabilizing in particular for the host domain because the chaperone domain interrupts the local chain connectivity between two ß strands. The stability of the chimeric enzymes could be improved by introducing naturally occuring linker sequences and introducing a disulfide bond within the linker region. Besides the increase in the stabilities of hFKBP12 and the guest domains, also the prolyl isomerase activity which was impaired by the domain insertion was reestablished by the optimization of the linker. In all chimeric proteins the folding helper activity of hFKBP12 was strongly improved. The chaperone domains abolish the high substrate specificity of the proly isomerase site and thus convert hFKBP12 into a generic folding enzyme. This was generally observed irrespective of the origin of the substrate binding domain. All three chaperone domains conveyed FKBP12 with a high affinity for unfolded proteins and dynamic binding properties. For the function of modular folding enzymes working in an energy independent manner a well balanced substrate affinity and highly dynamic substrate binding are generally important. Further artificial folding enzymes were created by insertion of the IF domain of SlyD into the parvulin domains of SurA. The presence of the IF domain conveyed both parvulin domains with an affinity for unfolded proteins and chaperone properties. Only one of these parvulin domains is a catalytically active prolyl isomerase, so only in this case, the insertion of the chaperone domain led to an enormously improved folding helper activity. The combination of prolyl isomerase domains and chaperone domains yields active chimeric folding helper enzymes. Separate sites for generic protein binding and for specific catalysis seem to be a general principle for highly active folding helpers.