The peptidyl-prolyl isomerase Pin1 is required for maintenance of the spindle assembly checkpoint

Titelangaben

Brown, Andreas:
The peptidyl-prolyl isomerase Pin1 is required for maintenance of the spindle assembly checkpoint.
Bayreuth , 2012 . - 135 S. S.
( Dissertation, 2012 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Chromosomes are replicated during S-phase and segregated during M-phase of the eukaryotic cell cycle. The two sister chromatids of each duplicated chromosome are topologically entrapped and, thus, paired by the ring-shaped protein complex cohesin. They are separated in anaphase of mitosis when cohesin is endoproteolytically cleaved by separase. Activation of this giant protease requires the degradation of its two inhibitors, securin and cyclin B1, which is mediated by the anaphase promoting complex or cyclosome (APC/C), a multisubunit ubiquitin ligase, in conjunction with its essential co-activator Cdc20. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a surveillance mechanism that monitors the chromosomes' interactions with the microtubules of the mitotic spindle apparatus. In response to even one erroneous attachment the affected kinetochore emits a "wait anaphase" signal, which is amplified and culminates in the quantitative sequestration of Cdc20 by the SAC components Mad2 and BubR1. The consequent inactivation of the APC/C causes a metaphase arrest and gives the cell time to correct the error. Given its great importance for chromosome segregation fidelity, it comes at no surprise that loss of the SAC causes cell death while its curtailing is associated with tumour formation. Pin1 is a peptidyl-prolyl-isomerase with strong preference for phosphorylated Ser-Pro or Thr-Pro motives within its protein substrates. In the present thesis, evidence for the involvement of Pin1 in the maintenance of a robust SAC response is presented. Antibodies against Pin1 were raised and used to establish the effective immunodepletion of Pin1 from extracts of Xenopus laevis eggs. While the SAC could readily be activated in mock-treated samples of this cell free system, securin was degraded despite the presence of unattached kinetochores when Pin1 had previously been removed. Proving the specificity of this effect, a SAC mediated arrest could be rescued by adding back recombinant Pin1 to depleted extracts. Similarly, addition of dominant negative but not of wild-type Pin1 to SAC-arrested extracts resulted in a checkpoint override. Chemical inhibition of human Pin1 with two different molecules in two different cancer cells lines invariably forced the cells to exit mitosis in the absence of spindles. This resulted in the premature disappearance of securin, cyclin B1 and a mitosis-specific phosphorylation on Ser10 of histone H3. Thus, Pin1's role as a checkpoint component is conserved in mammals. In search for the relevant target, Cdc20 was identified as a novel interaction partner of vertebrate Pin1. This association requires phosphorylation of Cdc20 on Ser-Pro/Thr-Pro sites and occurs only during mitosis. Importantly, the Pin1-Cdc20 interaction is direct and not bridged via another checkpoint component or a subunit of the core APC/C. The experimental data suggest that Pin1-dependent isomerization of Cdc20 might bias it to preferentially associate with Mad2 and BubR1 instead of APC/C. Taken together, these findings contribute to a better understanding of the molecular mechanisms involved in SAC signalling and unravel a previously unappreciated role of Pin1 for genome integrity.

Abstract in weiterer Sprache

Chromosomen werden während der S-Phase des eukaryotischen Zellzyklus repliziert und während der M-Phase voneinander getrennt. Die beiden Schwesterchromatiden eines jeden duplizierten Chromosoms sind räumlich verbunden und mit Kohäsin, einem ringförmigen Protein-Komplex, gepaart. Sie werden in der Anaphase der Mitose voneinander getrennt, nachdem Kohäsin endoproteolytisch durch Separase gespalten wurde. Die Aktivierung dieser großen Protease erfordert den Abbau seiner beiden Inhibitoren, Securin und Cyclin B1, was vom Anaphase Promoting-Komplex oder Zyklosom (APC/C), einer aus mehreren Untereinheiten bestehenden Ubiquitin-Ligase in Verbindung mit seinem wichtigen Co-Aktivator Cdc20, bewerkstelligt wird. Der „Spindle Assembly Checkpoint“ (SAC) ist ein Kontrollmechanismus, der die Anheftungen der Chromosomen mit den Mikrotubuli des mitotischen Spindelapparats überwacht. Als Antwort auf eine einzelne fehlerhafte Befestigung sendet das betroffene Kinetochor ein "Wait anaphase"-Signal aus, welches vielfach verstärkt wird und in der quantitativen Sequestrierung von Cdc20 durch die SAC-Komponenten Mad2 und BubR1 resultiert. Die konsequente Inaktivierung des APC/C verursacht einen Metaphase-Arrest und gibt der Zelle nun Zeit, den Fehler zu korrigieren. Angesichts seiner großen Bedeutung für die Chromosomensegregation, ist es nicht verwunderlich, dass der Verlust der SAC-Funktion den Zelltod verursacht, während seine Beeinträchtigung mit der Entstehung von Tumoren einhergeht. Pin1 ist eine Peptidyl-Prolyl-Isomerase mit starker Präferenz für phosphorylierte Ser-Pro- oder Thr-Pro-Motive innerhalb seiner Proteinsubstrate. In der hier vorliegenden Arbeit werden Hinweise für die Beteiligung von Pin1 im Aufrechterhalten einer robusten SAC-Antwort präsentiert. Es wurden Antikörper gegen Pin1 hergestellt und dazu genutzt, die effektive Immunodepletion von Pin1 aus Extrakten von Xenopus laevis Eiern zu etablieren. Während der SAC in kontroll-behandelten Proben dieses zellfreien Systems aktiviert werden konnte, wurde Securin trotz der Anwesenheit von freien Kinetochoren abgebaut, wenn Pin1 zuvor entfernt worden war. Ein SAC-vermittelter Arrest konnte durch Zugabe von rekombinantem Pin1 zu depletiertem Extrakt gerettet werden, was die Spezifität dieser Wirkung untermauert. Ebenso löste die Zugabe von dominant negativen, nicht aber von Wildtyp-Pin1 zu SAC-etablierten Extrakten, eine Deaktivieriung des SACs aus. Chemische Inhibierung des humanen Pin1 mit zwei verschiedenen Molekülen brachte zwei verschiedene Krebszellenlinien dazu, Mitose in Abwesenheit von Spindeln zu verlassen. Dies resultierte im Abbau von Securin, Cyclin B1 und Mitose-spezifischer Phosphorylierung des Serinrestes 10 von Histon H3. Somit ist die Rolle von Pin1 als SAC-Komponente bei Säugetieren konserviert. Auf der Suche nach dem relevanten Ziel wurde Cdc20 als neuer Interaktionspartner von Wirbeltieren-Pin1 identifiziert. Diese Interaktion erfordert die Phosphorylierung der SP/TP-Aminosäurereste von Cdc20 und tritt nur während der Mitose auf. Wichtig ist, dass die Interaktion von Pin1 mit Cdc20 direkt ist und nicht durch eine andere Komponente des SAC oder einer Untereinheit des APC/C vermittelt ist. Die experimentellen Daten deuten darauf hin, dass Pin1-abhängige Isomerisierung von Cdc20 zu einer bevorzugten Assoziierung mit Mad2 und BubR1 anstelle des APC/C führt. Zusammengenommen tragen diese Erkenntnisse zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen der SAC-Regulation bei und entschlüsseln eine bisher unbekannte Rolle von Pin1 für die genomische Integrität.