Untersuchung der Dynamik von Mitochondrien mit licht- und elektronenmikroskopischen Methoden

Titelangaben

Scholz, Dirk:
Untersuchung der Dynamik von Mitochondrien mit licht- und elektronenmikroskopischen Methoden.
Bayreuth , 2015 . - VIII, 101 S.
( Dissertation, 2014 , Universität Bayreuth, Fakultätsübergreifende Einrichtung)

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Abstract

Mitochondrien sind hochdynamische Organellen, die in vielen verschiedenen Zelltypen regelmäßig miteinander fusionieren und geteilt werden. Die Bäckerhefe S. cerevisiae ist ein idealer Modellorganismus, welcher sehr gut für die Untersuchung der mitochondrialen Dynamik geeignet ist. Durch die Verwendung moderner licht- und elektronenmikroskopischer Methoden wurden in dieser Arbeit verschiedene Aspekte der mitochondrialen Dynamik in S. cerevisiae untersucht. Nach Herstellung einer Sammlung verschiedener mitochondrialer Markerplasmide konnte mit Hilfe des photokonvertierbaren Fluoreszenzproteins Dendra2 ein Assay etabliert werden, der es ermöglicht, die Dynamik individueller Mitochondrien innerhalb einer Zelle spezifisch zu verfolgen. Das Dynamin-verwandte Protein Dnm1 ist in S. cerevisiae die Schlüsselkomponente der mitochondrialen Teilung. Es ist jedoch nicht bekannt, ob Dnm1 ausschließlich die Teilung der mitochondrialen Außenmembran vermittelt oder es ebenfalls für die Teilung der mitochondrialen Innenmembran verantwortlich ist. Proteine, welche die Teilung der mitochondrialen Innenmembran vermitteln, sind bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob Dnm1 möglicherweise an der Teilung der mitochondrialen Innenmembran beteiligt ist. In Kombination mit fluoreszenzmarkierten Dnm1-Varianten konnte mittels Photokonversionsassay gezeigt werden, dass an den Assemblierungspunkten von Dnm1 und Dnm1G185S eine Diskontinuität innerhalb der mitochondrialen Matrix vorhanden ist. Bei ultrastrukturellen Analysen möglicher Dnm1-Bindestellen wurden gegenüberliegende Cristae oder getrennte Innenmembranen an Einschnürungen der mitochondrialen Außenmembran beobachtet. Diese Beobachtungen sind Hinweise für einen koordinierten Ablauf bei der Teilung von mitochondrialer Innen- und Außenmembran. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde die Num1-vermittelte Verankerung der Mitochondrien untersucht. Num1 ist ein 313 kDa großes, kortikales Protein, welches eine wichtige Rolle bei der Migration des Zellkerns spielt und an der Verankerung der Mitochondrien am Zellkortex der Mutterzelle beteiligt ist. Elektronentomographische Untersuchungen der mitochondrialen Verankerungsstellen am Zellkortex zeigten Einstülpungen der Plasmamembran, welche direkte Kontakte zur mitochondrialen Außenmembran bildeten. Dementsprechend erfolgt die Befestigung der Mitochondrien in der Mutterzelle vermutlich über Kontakte mit der Plasmamembran. Die hier beschriebenen Einstülpungen der Plasmamembran an den mitochondrialen Verankerungsstellen zeigten eine auffallende Ähnlichkeit zu den Membraneinstülpungen, welche durch große, heterodimere, unbewegliche Proteinkomplexe an der Plasmamembran, sogenannte Eisosomen, gebildet werden. Ein unmittelbarer Zusammenhang zu den durch Eisosomen gebildeten Membraninvaginationen konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Während in S. cerevisiae und Säugetieren die mitochondriale Dynamik sehr gut untersucht und detailliert beschrieben wurde, ist über die mitochondriale Fusion in Algen und höheren Pflanzen nur sehr wenig bekannt. Um die Fusion von Mitochondrien in der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii nachzuweisen, wurden die Mitochondrien von Gameten unterschiedlichen Paarungstyps mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt. Die Durchmischung der Fluoreszenzfarbstoffe in den Zygoten zeigte die mitochondriale Fusion. Die Fusion der Mitochondrien konnte in Wildtypzygoten und mit geringerer Effizienz in Zygoten von respiratorischen Mutanten nachgewiesen werden. Daraus wird geschlussfolgert, dass Mitochondrien regelmäßig in Chlamydomonas reinhardtii fusionieren.

Abstract in weiterer Sprache

Mitochondria are highly dynamic organelles that constantly fuse and divide in many different cell types. The bakers’ yeast S. cerevisiae is an ideal model organism to study mitochondrial dynamics. Several aspects of yeast mitochondrial dynamics have been investigated in this work by using modern light and electron microscopic techniques. A versatile collection of mitochondrial marker plasmids was produced. A mitochondria-targeted version of the photoconvertible fluorescent protein Dendra2 was used to establish an assay that facilitates the tracking of individual mitochondria in yeast. The dynamin-related protein Dnm1 is the key component of the mitochondrial fission in S. cerevisiae. So far it is not known whether Dnm1 only mediates mitochondrial outer membrane fission or if it is also responsible for mitochondrial inner membrane fission. Specific proteins that mediate mitochondrial inner membrane fission are yet unknown. A putative participation of Dnm1 in the fission of the mitochondrial inner membrane was addressed in this work. In combination with different variants of Dnm1 the photoconversion of mitochondria-targeted Dendra2 revealed that the mitochondrial matrix is constricted at sites where Dnm1 or Dnm1G185S assemble at the mitochondrial surface. Ultrastructural analysis of putative Dnm1 binding sites uncovered opposing cristae structures or separated mitochondrial inner membranes at sites of mitochondrial outer membrane constriction. These results suggest a coordinated process for the fission of the mitochondrial inner and outer membranes. Another part of this study dealt with the Num1 mediated anchoring of mitochondria to the cell cortex. Num1 is a 313 kDa large cortical protein that is involved in nuclear migration and also functions in mitochondrial anchoring in the mother cell. Electron tomography of the anchoring sites revealed plasma membrane invaginations directly contacting the mitochondrial outer membrane. Thus, attachment of mitochondria in the mother appears to be established by contacts to the plasma membrane. The described invaginations of the plasma membrane showed a remarkable similarity to membrane invaginations formed by large, heterodimeric, immobile protein complexes that are called eisosomes. However, a direct coherence to the membrane invaginations formed by eisosomes could not be proven. While mitochondrial dynamics have been described in great detail in S. cerevisiae and mammals, only little is known about mitochondrial fusion in algae and higher plants. To investigate whether mitochondrial fusion occurs in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii, mitochondria were stained with fluorescent dyes in gametes. The mixing of fluorescent markers was detected by fluorescence microscopy in zygotes indicating mitochondrial fusion. The fusion of mitochondria was observed in wild type zygotes, and also in respiratory mutants, albeit with less efficiency. This suggests that mitochondria readily fuse in Chlamydomonas reinhardtii.