Rekombinante Herstellung und Charakterisierung flankierender Domänen der M. galloprovincialis preCol-Moleküle.

Titelangaben

Heim, Markus:
Rekombinante Herstellung und Charakterisierung flankierender Domänen der M. galloprovincialis preCol-Moleküle.
Bayreuth , 2014 . - III, 179 S.
( Dissertation, 2014 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Muscheln der Gattung Mytilus haben zur Besiedelung von Gezeitenzonen ein als Byssus bezeichnetes Verankerungssytem entwickelt, welches unter den dort vorherrschenden Bedingungen ein stabiles Anhaften am Untergrund und Schutz vor durch Wellen und Strömungen verursachten Kräften gewährleistet. Der strukturelle Kern eines jeden Byssusfadens, der für die Aufnahme und Dissipation mechanischer Kräfte hauptverantwortlich ist, wird von drei unterscheidbaren, als preCols bezeichneten Proteinen gebildet. Diese zeigen auf molekularer Ebene eine modulare Domänenstruktur. Die ungefähr die Hälfte des Proteins dominierende Kollagendomäne, an die carboxylterminal ein Cluster saurer Aminosäuren anschließt, sowie Termini, die durch einen hohen Anteil von Histidin sowie 3,4-Dihydroxyphenylalanin (DOPA) gekennzeichnet sind, sind allen drei preCols gemein. Unterschiede zeigen sich hauptsächlich in den die Kollagendomäne und den Cluster saurer Aminosäuren flankierenden Regionen, da diese entweder aus elastinähnlichen, aus seidenähnlichen oder aus glycinreichen Konsensusmotiven bestehen. Die Unterschiede zwischen den flankierenden Regionen sowie das spezifisches Verteilungsmuster der preCols entlang der Fadenachse spiegeln sich direkt in den entlang der Fadenachse variierenden mechanischen Eigenschaften der Byssusfäden wieder. Deshalb wird den flankierenden Regionen auch in erster Linie eine Rolle bei der Festlegung dieser mechanischen Eigenschaften zugeschrieben. Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es, die flankierenden Regionen der M. galloprovincialis preCols rekombinant als eigenständige Proteine in E. coli herzustellen, um durch deren biochemische und -physikalische Untersuchungen die Sequenz-Struktur-Funktions-Beziehungen detaillierter aufzuklären und dadurch weitere Informationen über Rolle und Funktion der flankierenden Domänen in vivo zu erhalten. Zunächst konnte eine Expressions- und Reinigungsstrategie entwickelt werden, die es ausgehend von einer cDNA-Datenbank des Muschelfußgewebes von M. galloprovincialis erlaubt, auf der Aminosäuresequenz der flankierenden Regionen beruhende flank-Proteine rekombinant herzustellen. Durch die Verwendung sowohl nativer wie auch an die Codonverwendung des prokaryotischen Wirtsorganismus angepasster Nukleotidsequenzen konnte gezeigt werden, dass das Auftreten von verkürzten Versionen der Zielproteine während der Proteinbiosynthese in erster Linie auf in vivo Abbauprozesse und weniger auf eine schlechte Translationseffizienz zurückzuführen war. Durch simultane Verwendung zweier großer, gefalteter tags konnte durch Abschirmung der eigentlichen flank-Sequenz deren in vivo-Abbau minimiert und über sequentielle tag-Abspaltungen und säulenchromatographische Reinigungsschritte schließlich rekombinantes flank-Protein hergestellt werden. Ein der carboxyterminal flankierenden Region von preCol-NG entsprechendes Protein (cwCT(F34W)) zeigte in verschiedenen wässrigen Lösungen eine intrinsisch entfaltete Struktur mit Hinweisen auf untergeordnete 31-helikalen Strukturanteile und war zeitlich wie auch thermisch stabil in Lösung. In Gegenwart bestimmter SUV kam es jedoch zur Induktion von Sekundärstruktur und einem Übergang der intrinsisch entfalteten hin zu einer β-faltblattdominierten Konformation. Die Art der Strukturinduktion ähnelt dem partitioning-folding coupling (PFC) bei der Faltung von Membranproteinen. Mit Hilfe einer whole-residue Hydrophobizitätsanalyse gelang die Identifizierung eines Aminosäurebereichs innerhalb von cwCT(F34W), der mit der SUV-Lipiddoppelmembran interagieren kann und der durch PFC-ähnliche Prozesse zudem zur Ausbildung einer β-Haarnadelkonformation neigt. Zudem sprechen die experimentellen und bioinformatischen Daten dafür, dass es zu einer Integration der β-Haarnadel in die SUV-Lipiddoppelmembran kommt. Die anhand von cwCT(F34W) gewonnenen Erkenntnisse legen nicht nur nahe, dass die carboxyterminal flankierende Region von preCol-NG auch während der Proteinassemblierung und Entstehung der Byssusfäden sowie deren Selbstheilung eine wichtige Rolle spielen kann, sondern eröffnet auch Möglichkeiten für die (Weiter-)Entwicklung selbst-heilender Biomaterialien.

Abstract in weiterer Sprache

Mussels of the genus Mytilus developed a holdfast structure called the byssus which enables them to tether to different substrates in intertidal zones, thereby withstanding the existent mechanical forces caused by water currents and swell. The load-bearing and energy dissipating core of the proteinaceous threads forming the byssus is primarily made up of three distinct proteins termed preCols. On a molecular level, these proteins reveal a modular structure showing distinguishable domains. Nearly half the preCol is made up of a central collagen domain, carboxyterminally succeeded by a cluster of acidic amino acids. Besides, the preCols also share similar terminal domains characterized by a high content in histidine and 3,4-dihydroxy-phenylalanine (DOPA) residues. In turn, differences between the different preCol types are mainly localized within the regions flanking the collagen domain and acidic patch, as those are composed of either silk-like, elastin-like or glycinerich consensus motifs. Differences between the flanking regions as well as the preCols distinct distribution pattern along the thread axis perfectly correlate with the threads’ longitudinally changing mechanical properties. Therefore it is widely accepted that one main function of the flanking regions is to determine and maintain byssus mechanics. To elucidate the sequence-structure-function relationships of the flanking regions in more detail and to gain more information about their roles in vivo, the work summarized herein aimed on the recombinant production of proteins resembling the flanking regions of M. galloprovincialis preCols as well as their subsequent biochemical and biophysical analysis. Based on a M. galloprovincialis derived cDNA library of mussel foot tissue, a strategy for the expression and purification of recombinant proteins mimicking the preCol flanking regions was successfully developed. By employing native as well as codon usage optimized nucleotide sequences, it could be shown that, during heterologous expression, the appearance of truncated versions of the target proteins was mainly caused by in vivo degradation rather than by inefficient translation processes. The simultaneous deployment of two large, folded tags minimized in vivo degradation, which, in turn, allowed isolation of pure flank protein by a subsequent series of tag-cleavage and column purification steps. In various aqueous solutions, the protein derived from the carboxyterminal flanking region of pre-Col-NG (cwCT(F34W)) adopted an intrinsically disordered conformation with some 31-helical content and displayed long-term as well as thermal stability. However, secondary structure formation was induced in presence of certain SUV, yielding a transition from an intrinsically disordered to a β-sheet dominated conformation. This resembles a step during membrane protein folding known as partitioning-folding coupling (PFC). Whole-residue hydrophobicity analysis was used to identify an amino acid stretch within cwCT(F34W) that is able to interact with the SUVs’ lipid double layer and is prone to fold into a β-hairpin conformation upon interaction. Experimental data and bioinformatics further suggest an integration of the β-hairpin into the lipid double layer. The abovementioned findings not only indicate that the carboxyterminal flanking region of preCol-NG could take over important roles during protein assembly, byssus formation and byssal self-healing processes but also enable a (further) development of self-healing biomaterials.