Spectroscopic Investigations of Light-Harvesting 2 Complexes from Rps. acidophila

Titelangaben

Kunz, Ralf:
Spectroscopic Investigations of Light-Harvesting 2 Complexes from Rps. acidophila.
Bayreuth , 2014 . - X, 138 S.
( Dissertation, 2014 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

A better understanding of light capturing and energy transfer processes in natural photosynthesis can contribute to the development of a highly efficient, artificial, molecular-based technology that utilizes the sun for mankind’s energy supply. Being a prominent example, the light-harvesting 2 (LH2) antenna complexes located in the photosynthetic apparatus of anoxygenic non-sulfur purple bacteria has already provided a deep insight into how nature has developed a pigment-protein complex with highly efficient light-harvesting and energy transfer characteristics on a confined nanoscale geometry. In order to gain more detailed information about the electronic structure in LH2 complexes from Rhodopseudomonas (Rps.) acidophila (strain 10050), the absorbing and emitting states of these antenna complexes have been studied in this thesis by means of ensemble as well as singlemolecule fluorescence-excitation and emission spectroscopy at low temperature. The outcome of this thesis helps to clarify some long-standing problems concerning the discrepancies between the absorption and emission characteristics of ensembles of isolated LH2 complexes from purple bacteria, as well as discrepancies between the spectroscopic results obtained from ensemble and single-molecule studies on these pigment-protein antenna complexes. It was shown that the optical spectra of the ensemble sample, either dissolved in bulk-buffer solution or, according to the single-molecule preparation method, embedded in a thin polymer film, strongly depend on the sample preparation conditions and temperature. For the first time, fluorescence-excitation and emission spectra of the same individual LH2 complexes could be recorded at 1.2 K. In these experiments a significant difference between the emission spectra of single complexes concerning the correlation between spectral positions and widths (full width at half maximum, FWHM) was found. This strongly implied the existence of a different electron-phonon coupling strength for each complex, and moreover, led to the conclusion that at least for some of the complexes an exciton self-trapping process is effective. In a subsequent experiment, series of emission spectra from individual LH2 complexes have been recorded at 1.2 K with a significantly improved spectral and temporal resolution. Drastic fluctuations of the emission profiles were found to occur within individual complexes. In addition, the correlation between the shape and the peak position of the emission spectra provides direct evidence for fluctuations of the electron-phonon coupling strength not only within single LH2 complexes, but also between different ones. Finally, a direct comparison of fluorescence-excitation and emission spectra that were recorded for the same individual LH2 complexes allowed, by reduction of spectral and temporal inhomogeneities, an unambiguous assignment of the lowest exciton state for some of the LH2 complexes. This experiment provides evidence that the emission of the lowest exciton state can result in a narrow zero-phonon line and that emission spectroscopy of isolated LH2 complexes is to great extent affected by fluctuations of the electron-phonon coupling strength in the individual complexes. The work has resulted in four publications which can be found in part II of the thesis. In a first step (publication P1), a comprehensive optical characterization of ensembles of isolated LH2 complexes has been performed as a function of sample preparation conditions and temperature by means of steady-state fluorescenceexcitation, emission and fluorescence-anisotropy excitation spectroscopy. Spectral parameters (peak position, FWHM of the absorption/emission band, Stokes shift, excitonic bandwidth, etc.) which have been obtained from the optical spectra of LH2 ensembles, either dissolved in a buffer-detergent solution (with/without glycerol) or embedded in a spin-coated thin polymer film, were compared with those from native membranes at ambient and cryogenic temperatures. While bufferdetergent solutions and the polymer film matrix are the environments commonly used in bulk and single-molecule spectroscopic studies, respectively, native membranes served as the reference in which the LH2 complexes are naturally embedded. The most remarkable finding was a significant blue-shift of the B850 excitonic absorption band at 5 K upon transfer of the LH2 complexes from bulk-buffer solution into the spin-coated polymer film. Within the molecular exciton model this shift could be disentangled into three parts, namely to an increase of the local site energies, a contraction of the exciton band, and a decrease of the displacement energy. These results help to facilitate the comparison of results from single-molecule studies with those obtained from ensemble studies. In the second step (publication P2), fluorescence-excitation and emission spectra of the same individual LH2 complexes have been recorded at 1.2 K for the first time. The recorded emission spectra could be related to two classes of complexes with distinctively different types of emission spectra. One class of antenna complexes showed spectra with a relatively narrow spectral profile and a clear signature of a zero-phonon line (ZPL), whereas the other class displayed spectra that consisted of a broad featureless band. Further analysis of the emission spectra revealed clear correlations between the peak position and width (FWHM) of the emission band. This observation clearly indicated that the electron-phonon coupling strength strongly varies from complex to complex, as well as being a function of the spectral peak position. Due to long integration times, however, the influence of fast unresolved spectral diffusion on the width of the broad spectra could not be fully ruled out. Next, emission spectra of single LH2 complexes were recorded at 1.2 K with enhanced spectral resolution and significantly reduced exposure times. This allowed recording of series of emission spectra (100 - 2000) with an unprecedented spectral and temporal resolution for 26 LH2 complexes. Narrow ZPLs as well as broad structureless spectra from the same individual complex could be observed, suggesting a strong spectral diffusion. A multivariate statistical algorithm (MSA) was applied to the emission spectra to surpass weak signal intensities and strong spectral diffusion, resulting in so-called class-averaged spectra (CAS). From analysis of the CAS in terms of spectral widths (FWHM) and peak positions it followed that for each complex the width of the red-most CAS is always larger than the blue-most CAS, whatever the actual profile of the spectrum looked like. This correlation of the spectral profiles with peak positions can be interpreted as different electronphonon coupling strengths within each individual LH2 complex. Moreover, this study revealed a much larger variety of the emission profiles than previously observed in P2 and testifies, for the first time, that the electron-phonon coupling of an individual pigment-protein complex cannot be regarded as static. The measured linewidths of the ZPLs (smaller/equal than 10 cm-1) in the individual spectra, are the narrowest ever observed in emission spectra of LH2 complexes. These results have been published in publication P3. Finally, the fluorescence-excitation and emission spectra that have been recorded from individual LH2 complexes at 1.2 K, both showing strong temporal and spectral fluctuations, were directly compared for each individual complex. This comparison revealed that for 2/3 of the complexes the fluorescence-excitation spectrum could not be fully recorded due to the cut-off of the detection filter characteristics. However, for those complexes with fully recorded fluorescence-excitation spectra, a correlation of the red-most spectral feature of the excitation spectrum with the blue-most spectral feature of the emission spectrum allows an unambiguous assignment of the lowest exciton state. Thus, the combination of fluorescence-excitation and emission spectroscopy on a single-molecule level allowed to surpass the spectral and temporal inhomogeneities such that the presence of the lowest exciton state in the excited state manifold of individual LH2 complexes could be unmasked for the first time. The results of this approach, which are in good agreement with the data obtained from spectral hole-burning studies, have been published in publication P4.

Abstract in weiterer Sprache

Ein besseres Verständnis der in der natürlichen Photosynthese auftretenden Lichteinfang- und Energietransferprozesse, kann zur Entwicklung hocheffizienter, künstlicher, auf Moleküle basierender Technologien beitragen, welche die Energie der Sonne zur Energieversorgung der Menschheit nutzbar macht. Als besonders eindrucksvolles Beispiel kann hier der Lichtsammelantennenkomplex 2 (LH2), welcher sich im Photosyntheseapparat der anoxygenen nicht-schwefelhaltigen Purpurbakterien befindet, genannt werden. Aus Pigmenten und Proteinen hat die Natur einen Komplex auf der Nanoskala gebildet, der hocheffiziente Lichtsammel- und Energietransfereigenschaften in sich vereinigt. Um mehr über die elektronische Struktur des LH2 Komplexes der Spezies Rhodopseudomonas (Rps.) acidophila (strain 10050) zu erfahren, wurden in der vorliegenden Dissertation die absorbierenden und emittierenden Zustände dieses Antennenkomplexes anhand von Fluoreszenz-Anregungsund Emissionsspektroskopie im Ensemble und auf der Einzelmolekülebene, bei tiefen Temperaturen, untersucht. Die Resultate der Dissertation helfen einige, seit langem bestehende Probleme aufzuklären, die einerseits auf Diskrepanzen zwischen den Absorptions- und Emissionscharakteristika isolierter, im Ensemble gemessener LH2 Komplexe von Purpurbakterien beruhen und andererseits auf widersprüchliche Erkenntnisse aus Ensembleund Einzelmolekülspektroskopiestudien dieser Pigment-Protein-Komplexe zurückzuführen sind. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die optischen Spektren einer Ensembleprobe stark von den Präparationsbedingungen der Probe (in Puffer-Detergenz- Lösung oder eingebettet in einem Polymerfilm) sowie der Temperatur abhängen. Erstmalig wurden Fluoreszenz-Anregungs- und Emissionsspektren von den gleichen, einzelnen LH2 Komplexe bei einer Temperatur von 1.2 K gemessen. In diesen Experimenten konnte ein bedeutender Unterschied zwischen den Emissionsspektren der Komplexe bezüglich der Korrelation ihrer spektralen Position und ihrer Breite (Halbwertsbreite, FWHM) festgestellt werden. Dies gab Anlass zu Vermutung, dass innerhalb der Komplexe verschieden starke Elektron-Phonon-Kopplungen vorherrschen. Zudem führte es zu der Schlussfolgerung, dass in einigen der untersuchten Komplexe ein sogenannter Exciton-Self-Trapping Prozess auftritt. In einem weiterem Experiment wurden Serien von Emissionsspektren einzelner LH2 Komplexen mit einer deutlich verbesserten spektralen und zeitlichen Auflösung bei einer Temperatur von 1.2 K aufgenommen. Hierbei wurden erhebliche Fluktuationen der Emissionsprofile beobachtet. Eine Korrelation zwischen der Form und der Position des Maximums des Spektrums, erbrachte zusätzlich den Nachweis, dass die Elektron-Phonon-Kopplungsstärke nicht nur innerhalb eines einzelnen LH2 Komplexes fluktuiert, sondern auch zwischen den Komplexen unterschiedlich ist. Der direkte Vergleich der Fluoreszenz-Anregungs- und Emissionsspektren, welche von den gleichen, einzelnen LH2 Komplexen aufgenommen wurden, ermöglichte das Umgehen spektraler und zeitlicher Inhomogenitäten und dadurch für einige LH2 Komplexe eine eindeutige Bestimmung des untersten, anregbaren Exzitonenzustands. Dieses Vorgehen lieferte den Beweis, dass die Emission aus dem untersten Exzitonenzustand eine schmale Null-Phononenlinie aufweisen kann und dass die Emissionsspektroskopie isolierter LH2 Komplexe zu einem großen Anteil von Fluktuationen der Elektron-Phonon-Kopplungsstärke innerhalb der einzelnen Komplexe beeinflusst ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit resultierten in vier Publikationen, welche im Teil II der Arbeit zu finden sind. Im ersten Schritt (Publikation P1) erfolgte eine umfassende, optische Charakterisierung von Ensembleproben isolierter LH2 Komplexe als Funktion der Präparationsbedingungen und der Temperatur mithilfe der Fluoreszenz-Anregungs-, Emissions- und Fluoreszenz-Anisotropie-Anregungsspektroskopie. Hierbei wurden spektrale Parameter (Position der Bande, FWHM der Absorptions-/Emissionsbande, Stokes-Verschiebung, exzitonische Bandbreite, etc.) von LH2 Ensembles, welche entweder in einer Puffer-Detergenz-Lösung (mit/ohne Glycerol) oder in einem gespincoateten, dünnen Polymerfilm eingebettet waren, mit denen einer nativen Membran bei Umgebungs- und Tieftemperatur verglichen. Zwischen den Absorptionsspektren der LH2 Komplexe, welche sich in der Puffer-Detergenz-Lösung und im aufgeschleuderten Polymerfilm befinden, wurde bemerkenswerterweise eine erhebliche Blauverschiebung der B850-Exzitonenbande, bei einer Temperatur von 5 K, festgestellt. Innerhalb des Exziton-Modells konnten dieser Verschiebung drei Ursachen zugeordnet werden. Erstens einem Anstieg der lokalen Bindungsenergien, zweitens der Kontraktion der Exzitonenbande und drittens der Abnahme der sogenannten Displacement-Energie. Diese Erkenntnisse ermöglichen einen besseren Vergleich zwischen den Resultaten aus Ensemblestudien und denen aus Einzelmolekülexperimenten. Im zweiten Schritt (Publikation P2) wurden Fluoreszenz-Anregungs- und Emissionsspektren derselben LH2 Komplexe bei 1.2 K erstmalig aufgenommen. Die gemessenen Emissionsspektren konnten aufgrund ihres Aussehens in zwei Klassen von Komplexen mit sich stark voneinander unterscheidenden Emissionsspektren eingeteilt werden. In eine Klasse wurden diejenigen Antennenkomplexe eingeteilt, welche ein relativ schmales spektrales Profil sowie eine klare Signatur einer Null- Phononenlinie (ZPL) erkennen ließen. Die andere Klasse hingegen, bestand aus den Komplexen, deren Emissionsspektren eine breite, unstrukturierte Bande aufwies. Eine weitere Analyse der Spektren ergab, dass eine klare Korrelation zwischen der spektralen Position der Bande und ihrer FWHM besteht. Diese Beobachtung deutete an, dass die Elektron-Phonon-Kopplungsstärke von Komplex zu Komplex nicht nur stark variiert, sondern auch mit der spektralen Position der Emissionsbande zusammenhängt. Aufgrund der langen Integrationszeiten, konnte der Einfluss schneller spektraler Diffusion auf die Halbwertsbreite der Spektren hier jedoch nicht vollständig ausgeschlossen werden. In einem dritten Schritt wurden die Emissionsspektren einzelner LH2 Komplexe bei 1.2 K mit einer wesentlich höheren spektralen Auflösung und reduzierten Auslesezeiten aufgenommen. Für 26 LH2 Komplexe konnten so ganze Serien von Emissionsspektren (100 - 2000) mit bislang unerreichter spektraler und zeitlicher Auflösung aufgezeichnet werden. In diesen wurden sowohl scharfe Null-Phononenlinien als auch breite, strukturlose Spektren von ein- und denselben Komplexen beobachtet, was auf eine starke spektrale Diffusion hindeutete. Die Anwendung eines multivariaten statistischen Algorithmus auf diese Spektren, mit welchem dem Problem kleiner Signalintensität und spektraler Diffusion begegnet werden konnte, resultierte in sogenannten klassengemittelten Spektren (CAS). Eine Analyse der CAS in Bezug auf ihre Halbwertsbreite und der Position ihrer Maxima ergab, dass für jeden Komplex die Breite des CAS, welches das Maximum am weitesten im langwelligen Spektralbereich besitzt, stets größer ist, als dasjenige CAS, dessen Maximum bei der kürzesten Wellenlänge liegt. Dies gilt unabhängig davon, welches tatsächliche Profil die Spektren aufwiesen. Eine solche Korrelation der Emissionsprofile mit ihren spektralen Positionen, kann als unterschiedliche Elektron-Phonon-Kopplung innerhalb eines jeden einzelnen LH2 Komplexes aufgefasst werden. Überdies, konnte hierbei, im Gegensatz zur Publikation P2, eine weitaus größere Vielfalt an Emissionsprofilen nachgewiesen werden, was gleichzeitig ein Beleg dafür ist, dass die Elektron-Phonon-Kopplung eines einzelnen LH2 Komplexes nicht als statisch angesehen werden kann. Die gemessenen Linienbreiten der Null-Phononenlinien (kleiner/gleich 10 cm-1) sind die schmalsten, die jemals in LH2 Emissionsspektren beobachtet werden konnten. Diese Erkenntnisse wurden in der Publikation P3 veröffentlicht. Im letzten Schritt wurden alle, im Rahmen dieser Arbeit bei 1.2 K gemessenen Fluoreszenz-Anregungs- und Emissionsspektren einzelner LH2 Komplexe, welche beide starke zeitliche und spektrale Fluktuationen aufwiesen, für jeden Komplex direkt miteinander verglichen. Aus diesem Vergleich ergab sich, dass, aufgrund der Detektionsfiltercharakteristik, für zwei Drittel aller Komplexe, das Anregungsspektrum nicht vollständig aufgenommen werden konnten. Für diejenigen Komplexe jedoch, deren Anregungsspektren vollständig aufgezeichnet werden konnten, hat die Korrelation der spektralen Eigenschaften am langwelligen Ende des Anregungsspektrums mit den spektralen Eigenschaften im kurzwelligen Wellenlängenbereich des zugehörigen Emissionsspektrums, eine eindeutige Zuweisung des untersten Exzitonenzustands ermöglicht. Damit konnte gezeigt werden, dass sich durch Kombination von Fluoreszenz-Anregungs- und Emissionsspektroskopie auf der Einzelmolekülebene, spektrale und zeitliche Inhomogenitäten umgehen lassen und dadurch eine Bestimmung des untersten, anregbaren Zustands der B850 Exzitonenbande, für einzelne LH2 Komplexe möglich ist. Die Ergebnisse dieser Herangehensweise, welche in der Publikation P4 veröffentlicht wurden, decken sich weitgehend mit den Daten, die aus spektralen Lochbrennexperimenten gewonnen wurden.