(alpha)-Glucan-Phosphorylasen aus Weizen (Triticum aestivum L.) Isolierung, Charakterisierung und Analyse der Expression

Titelangaben

Schupp, Nicole:
(alpha)-Glucan-Phosphorylasen aus Weizen (Triticum aestivum L.) Isolierung, Charakterisierung und Analyse der Expression.
Bayreuth , 2002
( Dissertation, 2002 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Pflanzliche a-Glucan-Phosphorylasen (EC 2.4.1.1) können Stärke sowohl synthetisieren als auch abbauen. In Blättern und Körnern des Weizen var. Star können drei Phosphorylaseformen (P1, P2 und P3) mittels nicht-denaturierender Elektrophorese im Glycogen-haltigen Polyacrylamidgel unterschieden werden. Zwei der Formen (P1 und P2) sind cytosolische Enzyme, jedoch hat nur P1 die den cytosolischen Phosphorylasen eigene hohe Bindungsaffinität zu verzweigten Polyglucanen. Die dritte Form (P3) ist plastidisch und zeigt die für diesen Typ typische höhere katalytische Affinität zu Maltooligosacchariden verglichen mit verzweigten Polyglucanen. In der vorliegenden Arbeit wurde die cytosolische Phosphorylase aus Weizen-blättern mittels einer Affinitätschromatographie an dem an Sepharose gekoppelten Aktivitätsinhibitor Cycloheptaamylose bis zur Homogenität gereinigt. Die Phosphory-lase besteht aus einem Polypeptid, das nach denaturierender Polyacryl-amidgelelektrophorese ein Molekulargewicht von ca. 92 kD aufweist. Sie hat eine spezifische phosphorolytische Aktivität von 57 U/mg Protein, was einer ca. 7000-fa-chen Anreicherung bei einer Ausbeute von 32 % entspricht. Da das Protein die bei-den Phosphorylaseformen P1 und P2 bildet, liegt es vermutlich in zwei verschiede-nen Formen vor, von denen eine eine Maskierung des Polyglucan-Bindungsbereichs aufweist. Die höchste Aktivität hat die cytosolische Weizen-Phosphorylase, wie andere cytosolische Phosphorylasen, sowohl in der abbauenden als auch in der synthetisierenden Reaktion mit großen, verzweigten Polyglucanen im Vergleich zu linearen Maltooligosacchariden als Substrat. Ihre katalytische Affinität zu Amylopektin ist in der abbauenden Reaktion ca. 30mal höher als zu Maltoheptaose, in der Synthesereaktion sogar ca. 150mal höher. Die Umsatzgeschwindigkeiten mit verschiedenen Glucanen als Substrat sind in der Synthesereaktion vier- bis sieben-mal höher als in der abbauenden Reaktion. Maltopentaose ist das kleinste Substrat, das abgebaut werden kann, während Maltotetraose als Primer für die Glu-cansynthese dienen kann. Das pH-Optimum der abbauenden Reaktion liegt mit pH 7,0 etwas höher als das der Synthesereaktion (pH 6,0). Reduzierende Agenzien haben keinen Einfluss auf die Aktivitäten der cytosolischen Phosphorylase. Gegen das Protein der cytosolischen Phosphorylase wurden polyklonale Antikör-per hergestellt. Sie reagierten mit der gereinigten cytosolischen Phosphorylase und entsprechend großen Polypeptiden in Weizenextrakten, nicht aber mit Proteinen von Extrakten, die nur plastidische Phosphorylase enthielten. In hoher Konzentration re-agierte das Serum im Westernblot-Verfahren auch mit anderen Proteinen von Wei-zenextrakten, schien aber in geeigneter Verdünnung spezifisch für die cytosolische Phosphorylase zu sein. Aus einer cDNA-Bank aus jungen Weizenblättern wurde die cDNA einer cytosoli-schen Phosphorylase kloniert. Das erste Methionin (Met 20) der abgeleiteten Amino-säuresequenz des von Anfang an offenen Leserasters der cDNA stellt mit höchstwahrscheinlich den Translationsstart dar. Auch nach Verlängerung des 5´-Endes um 87 Basen in 5´-Richtung konnte kein Stoppcodon, aber auch kein weiteres Methionincodon entdeckt werden. Eine cDNA einer plastidischen Phosphorylase konnte nicht aus der Blatt-cDNA-Bank isoliert werden, aber aus einer cDNA-Bank aus Endosperm einer anderen Weizensorte. Die Sequenzen der beiden cDNAs dienten zur Herstellung spezifischer Primer, mit denen Fragmente von Phosphorylase-cDNAs aus Blättern und Körnern des Weizen var. Star amplifiziert werden konnten. Durch RACE konnten mit anhand dieser Fragmente hergestellten Primern cDNAs einer cytosolischen Phosphorylase aus Körnern und je zweier plastidischer Phosphorylasen aus Blättern und Körnern amplifiziert werden, die nur an den 5´-Enden noch vervollständigt werden müssen. In Blättern ist die Aktivität der cytosolischen Phosphorylase weitgehend auf junge, stark wachsende Primärblätter beschränkt. In Körnern wird sie während der späten Kornentwicklung höchstwahrscheinlich im Embryo gebildet und bleibt dort aktiv während der Keimung. Somit könnte die cytosolische Phosphorylase wichtig für die Aufrechterhaltung eines cytosolischen Glucose-1-Phosphatpools in Geweben sein, die massiv antransportierte Reservestärke-Abbauprodukte für das Wachstum des Keimlings verarbeiten müssen. Die Aktivität der plastidischen Phosphorylase bleibt langfristig in ausgewachsenen Blättern erhalten. Sie ist vermutlich am Metabolismus der transitorischen Stärke dieser Blätter beteiligt, zeigt aber keine diurnale Aktivitätsschwankung. Eine transient hohe Aktivität zeigte die plastidische Phosphorylase ebenfalls beim Einsetzen massiver Stärkesynthese im sich ent-wickelnden Korn. Da auch das Expressionsmuster ihres Transkripts dem der Stärke-synthetisierenden Enzyme ADP-Glucose-Pyrophosphorylase und Stärkesynthase ähnelt, spielt die plastidische Phosphorylase möglicherweise eine Rolle bei der Initi-ierung der Synthese von Reservestärke

Abstract in weiterer Sprache

Plant a-glucan phosphorylases (EC 2.4.1.1) of are enzymes which can synthesize starch as well as degrade it. In leaves and seeds of the wheat cultivar "Star" three forms of phosphorylase (P1, P2 and P3) can be distinguished by electrophoresis in non-denaturing polyacrylamide gels containing glycogen. Two of the forms (P1 and P2) are cytosolic enzymes, but only P1 shows the strong binding affinity to branched polyglucans typical of cytosolic phosphorylases. The third form (P3) is plastidic and exhibits the higher catalytical affinity to maltooligosaccharides than to branched polyglucans typical of plastidic phosphorylases. In the present study the cytosolic phosphorylase of wheat leaves was purified to homogeneity by affinity chromatography on the activity inhibitor cycloheptaamylose coupled to Sepharose. The purified phosphorylase consists of a single polypeptide species which has a molecular weight of approximately 91,5 kD according to denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. It has a specific phosphorolytic activity of 57 U/mg protein, corresponding to a purification factor of about 7000-fold and a yield of 32 %. The purified protein corresponds to both P1 and P2 and their differing binding affinities to glycogen. It thus probably occurs in two different forms, in one of which the polyglucan-binding region of the enzyme is masked. The purified cytosolic phosphorylase of wheat is much more active with branched polyglucans than with linear maltooligosaccharides as substrates in both the synthesis and the degradation of glucans, as are other non-plastidic phosphorylases. The catalytic affinity of the wheat enzyme to amylopectin is 30-fold higher than to maltoheptaose during phosphorolysis and as much as 150-fold higher respective of glucan synthesis. The maximum velocity of the synthesizing reaction with various glucans as substrates is four to seven times higher than that of the degrading reaction. The smallest substrate which can be degraded by the cytosolic phosphorylase is maltopentaose, whereas the smaller maltotetraose is sufficiently long to be a primer in the synthesis of reaction. The pH-optimum of the degrading reaction (pH 7.0) is slightly more alkaline than that of the synthesizing reaction (pH 6.0). Reducing agents had no influence on the activities of the cytosolic phosphorylase. The protein of the cytosolic phosphorylase was used to raise polyclonal antibodies which reacted with the purified cytosolic phosphorylase and proteins of a corresponding size in extracts of wheat tissues. They did not react with any proteins in extracts containing only the plastidic phosphorylase. At high concentrations the antiserum reacted with other proteins of wheat extracts in Western blot analysis, but it was essentially specific for the cytosolic phosphorylase at appropriate dilution. A cDNA of a cytosolic phosphorylase was isolated by screening a cDNA library of young wheat leaves. Although the cDNA consists of an open reading frame from its 5´-inception, the first methionine of the deduced amino acid sequence of the cDNA (Met 20) most probably constitutes the initial amino acid of the translated protein. No stop codon or further methionine codon was detected upon extending the 5´-end for 87 base pairs. No cDNA coding for a plastidic phosphorylase could be isolated from the leaf cDNA, but a fragment of such a cDNA was isolated from a cDNA library of the endosperm of another wheat cultivar. The sequences of the two cDNAs were used to design primers to amplify fragments of phosphorylase cDNAs of leaves and seeds of the wheat cultivar "Star". Specific primers deduced from the sequences of these fragments were used to amplify cDNAs of a cytosolic phosphorylase of seeds and of two plastidic phosphorylases of each of leaves and seeds by RACE. These cDNAs are all complete at their 3´-ends, but must still be brought to completion at their 5´-ends. In leaves activity of the cytosolic phosphorylase is mostly restricted to young growing primary leaves. In seeds the enzyme accumulates in the embryo during the late phase of seed development and remains active there throughout germination. The cytosolic phosphorylase could therefore be important for maintaining a cytosolic glucose-1-phosphate pool in tissues which process incoming reserve starch degradation products. Activity of the plastidic phosphorylase is detectable in fully grown leaves for an extended duration. It is presumably involved in the metabolism of transitory starch of these leaves, although no diurnal variation of its activity could be detected. A transient peak of activity of the plastidic phosphorylase was observed during the onset of massive starch synthesis in developing seeds. As the pattern of the transcript expression of this enzyme resembles that of the starch synthesizing enzymes ADP-glucose pyrophosphorylase and starch synthase, it can be expected that the plastidic phosphorylase plays a role in the initiation of reserve starch synthesis.