The regulation of digestive enzyme release in the two-spotted field cricket Gryllus bimaculatus (de Geer): effects of endogenous and environmental factors

Titelangaben

Weidlich, Sandy:
The regulation of digestive enzyme release in the two-spotted field cricket Gryllus bimaculatus (de Geer): effects of endogenous and environmental factors.
Bayreuth , 2013 . - IV, 117 S.
( Dissertation, 2013 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Insects are the most abundant animal species on earth with a huge economical and ecological impact. In spite of intensive research in the field of integrated pest management there are still a lot of questions concerning the adaptation mechanism of insects to their environment. As the digestive tract displays a putative target for effective pest management, this study worked on the effects of endogenous and environmental factors on digestive enzyme release in the omnivorous cricket, Gryllus bimaculatus. The age-dependent enzyme release of carbohydrases, proteases and lipase correlates with the daily feeding rate of the crickets and peaked between days 2 to 4 in last instar larvae as well as in adult crickets. In contrast, the secretion of chitinase was affected by the moulting cycle of the insects reaching maximum activity at the day of moult. Therefore, chitinase plays only a minor role in food digestion. The cellulase activity in the midgut of G. bimaculatus resulted from an endogenous cellulase and was not caused by bacteria or eukaryotic endosymbionts in the digestive tract. The endoprotease trypsin was stored in the caecal tissue as an inactive precursor, and is secreted to the lumen by exocytosis. Following activation Gryllus-trypsin (~24 kDa) is protected from proteolytic degradation, but there is no endogenous protease inhibitor in the midgut. Gene knockdown by RNA interference was used to analyse the endogenous regulation of digestive enzyme release by the neuropeptides allatostatin A and sulfakinin, which had already been shown to affect feeding in G. bimaculatus. Functional analysis of the AST-A gene was investigated for last instar larvae and adult crickets, whereby female crickets seemed to be more sensitive to this method. The gene suppression of AST-A resulted in a decreased synthesis of amylase, trypsin, aminopeptidase and lipase in the caecal tissue, but enzyme release varied between sexes and developmental stages. The knockdown of SK expression led to an increase of amylase and cellulase secretion in female crickets, and to a reduction of protease and lipase release in males. As food plays a fundamental role in digestive enzyme release, both quality and quantity of nutrition are ample factors. There was always a higher digestive enzyme activity in fed crickets compared to starved ones. Furthermore, starvation resulted in a decrease of enzyme synthesis in the caecal tissue. In general, nutrients in the incubation medium led to a stimulation of digestive enzyme secretion, but in the case of cellulase the presence of both cellubiose in the incubation medium and cellulose in the diet caused a strong decline in cellulase release. Addition of the plant protease inhibitor SBTI to the diet caused a dose-dependent inhibition of protease activity in the caeca, whereby minor concentrations of SBTI were compensated by enzyme hyperproduction. In addition to the food uptake, the daily light-dark cycle seems to affect digestive enzyme release. Crickets started to feed at the beginning of the scotophase, which led to an increase of protease and lipase secretion in larvae and adults. The secretion of carbohydrases was highest during the photophase. This means that enzyme release is not solely affected by the time of food uptake. Temperature is one of the most important environmental factors, but seems to play only a minor role in the release of digestive enzymes. All tested enzymes showed a broad optimal temperature range (30°C-40°C), but there was no difference in the release of amylase or lipase after tissue incubation at 25°C or 35°C. In contrast, trypsin and aminopeptidase showed a higher secretion after incubation at 35°C compared to 25°C. Furthermore, insect rearing at 22°C and 32°C during various developmental stages resulted in a positive acclimation of trypsin secretion to rearing temperature.

Abstract in weiterer Sprache

Insekten stellen mit Abstand die größte und vielfältigste Tiergruppe auf Erden dar und üben einen großen ökologischen wie auch ökonomischen Einfluss aus. Trotz intensiver Forschung im Bereich der integrierten Schädlingsbekämpfung sind bislang noch viele Fragen über die Adaptionsmechanismen von Insekten gegenüber ihrer Umwelt ungeklärt. Da der Verdauungstrakt von Insekten ein potentielles Angriffsziel für effektive Schädlingsbekämpfung darstellt, wurde innerhalb dieser Studie die Freisetzung von Verdauungsenzymen bei der omnivoren Grille, Gryllus bimaculatus, in Abhängigkeit von endogenen und Umweltfaktoren (Temperatur, Licht-Dunkel Rhythmus, Futter) analysiert. Die Freisetzung von Carbohydrasen, Proteasen und Lipasen in den Caeca von adulten und larvalen G. bimaculatus korreliert stark mit der täglichen Futteraufnahme. Dabei wurde eine maximale Enzymsekretion zwischen Tag 2 und 4 des letzten Larvenstadiums bzw. des Adultstadiums gefunden. Die Freisetzung von Chitinase wird hingegen maßgeblich vom Zeitpunkt der Häutung beeinflusst, so dass Chitinase bei der Nahrungsverwertung eher eine untergeordnete Rolle spielt. Darüber hinaus wird vermutet, dass die gemessene Cellulaseaktivität in den Caeca auf eine endogene Cellulase zurückzuführen ist, da aufgrund der Probenaufarbeitung mögliche eukaryotischen Endosymbionten oder Bakterien aus dem Darm entfernt wurden. Nähere Untersuchungen an der Protease Trypsin zeigten, dass das Enzym in Form einer Vorstufe (Zymogen) im Darmgewebe gespeichert wird. Die Freisetzung erfolgt über Exocytose aus den zymogenen Zellen des Mitteldarmes in das Darmlumen. Nach Aktivierung der Vorstufe wies das Gryllus-Trypsin ein Molekulargewicht von ~24 kDa auf und war gegen proteolytischen Abbau im Lumen geschützt. Eine Regulation der Proteaseaktivität im Mitteldarm durch endogene Protease-Inhibitoren konnte nicht gefunden werden. Mithilfe der RNA-Interferenz Methode (Gen-Knockdown) wurde die endogene Steuerung der Enzymsekretion im Mitteldarm durch die Neuropeptide Allatostatin A und Sulfakinin näher untersucht. Beide Peptide beeinflussen nachweislich die Futteraufnahme der Tiere. Die Funktionsanalyse des Allatostatin A Gens auf physiologischer Ebene wurde an Larven und adulten Grillen durchgeführt, wobei Weibchen auf die Methode sensibler zu reagieren scheinen. Gensuppression von AST-A führte meist zu einer reduzierten Syntheserate von Amylase, Trypsin, Aminopeptidase und Lipase in den Caeca-Geweben. Dabei schwankte die Höhe der Freisetzung zwischen den untersuchten Stadien und Geschlechtern. Der Knockdown der Sulfakininexpression führte hingegen zu einer deutlichen Erhöhung der Amylase- und Cellulasesekretion bei Weibchen, während bei Männchen ein Trend zu reduzierter Protease- und Lipasefreisetzung ersichtlich war. Sowohl die Quantität als auch die Qualität der Nahrung haben einen maßgeblichen Einfluss auf die Freisetzung aller untersuchten Enzyme. Gefütterte Tiere wiesen stets eine höhere Aktivität und eine stärkere Freisetzung der Verdauungsenzyme auf als gehungerte Grillen. Längere Hungerphasenführten zu einer Reduktion der Enzymaktivität im Darm und zu einer deutlich verminderten Syntheserate in den Caeca-Geweben. Obwohl die Anwesenheit von Nährstoffen im Inkubationsmedium eher stimulierend auf die Freisetzung der Enzyme wirkte, konnte bei Cellulase eine starke Reduktion der Sekretion bei Anwesenheit von Cellubiose im Inkubationsmedium oder Cellulose in der Nahrung festgestellt werden. Zusatz des pflanzlichen Protease-Inhibitors SBTI zur Nahrung führte zu einer konzentrationsabhängigen Reduktion der Aktivität und Freisetzung von Trypsin in den Caeca, wobei die Grillen geringere Konzentrationen an SBTI durch Enzym-Hyperproduktion kompensieren konnten. Neben der Futteraufnahme wurde die Freisetzung der Verdauungsenzyme durch den Tag-Nacht-Rhythmus der Tiere beeinflusst. Das Einsetzen der Futteraufnahme zu Beginn der Dunkelphase erklärt die erhöhte Protease- und Lipasefreisetzung, jedoch konnte in adulten wie larvalen G. bimaculatus ein Anstieg der Freisetzung von Carbohydrasen während der Photophase verzeichnet werden. Die Regulation der Enzymfreisetzung wird folglich nicht allein durch den Zeitpunkt der Futteraufnahme bestimmt. Temperatur als Umweltfaktor spielt bei der Freisetzung von Verdauungsenzymen in G. bimaculatus eine eher untergeordnete Rolle. Obwohl alle untersuchten Enzyme Temperaturoptima im Bereich von 30°C-40°C aufwiesen, zeigten Lipase und Amylase keinen Unterschied in der Freisetzung nach Gewebeinkubationen bei 25°C oder 35°C. Die Sekretion von Proteasen hingegen war bei 35°C Inkubationstemperaturdeutlich erhöht. Bei längerer Zucht der Tiere bei 22°C und 32°C konnte nur für Trypsin eine Anpassung der Sekretionsrate an die Haltungstemperatur in Form einer positiven Akklimatisation gefunden werden.