Title data
Suhre, Michael H.:
Struktur-/Funktionsbeziehung rekombinant hergestellter Proteine aus dem Byssusfaden der Miesmuschel Mytilus galloprovincialis.
Bayreuth
,
2013
(
Doctoral thesis,
2013
, University of Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT)
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Abstract
Marine Muscheln der Gezeitenzone, wie die Miesmuschel Mytilus galloprovincialis, haften mittels eines Byssus am Untergrund. Der Muschelbyssus besteht aus einzelnen Fäden, welche aufgrund von Strömungen und Wellengang extremen mechanischen Belastungen ausgeliefert sind und aus diesem Grund eine hohe Energieaufnahmefähigkeit besitzen. Unter anderem dieser Umstand macht die Byssusfäden zu einem interessanten biologischen Material. Byssusfäden gliedern sich in drei morphologisch unterscheidbare Abschnitte mit unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften, einen elastischen proximalen Teil, einen distalen Teil mit hoher Steifigkeit und einen adhäsiven Plaque, welcher die Substratbindestelle darstellt. Der Byssus besteht fast ausschließlich aus Proteinen, wovon wiederum ein großer Teil des Fadens durch fibrilläre Kollagene repräsentiert ist, welche in eine Proteinmatrix eingebettet sind. Nahezu alle Proteine des Byssusfadens weisen z. T. einen hohen Grad an posttranslationalen Modifikationen auf, allen voran die Hydroxylierung von Tyrosinen zu 3,4-Dihydroxy-phenylalaninen (DOPA). Diese Reste nehmen eine Schlüsselrolle für die kohäsiven und adhäsiven Eigenschaften der Byssusproteine ein. Ferner spielt die Oxidation von DOPA zum entsprechenden o-Chinon eine wichtige Rolle bei der Quervernetzung der Proteine im Zuge der Reifung bzw. chinonbasierter Gerbung (quinone tanning) der Fäden. Diese Reaktion wird von einer im Byssusfaden detektierten Catecholoxidase katalysiert, von der bis dato jedoch keine Aminosäuresequenz bekannt war. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig die Sequenz einer solchen mutmaßlichen Byssuscatecholoxidase in einer cDNA-Bank des Muschelfußes identifiziert und eingehend bioinformatisch hinsichtlich Lokalisierung und potenzieller Tertiärstruktur charakterisiert. Das entsprechende Protein weist einige Charakteristika auf, die die Identität mit einer von J. H. Waite aus dem Byssusfaden isolierten Catecholoxidase wahrscheinlich machen. Neben einer katalytischen Domäne, welche Homologie zu bekannten Catecholoxidasen bzw. Tyrosinasen aufweist, zeigt das Protein ferner weitere spezielle Bereiche, die eine strukturelle Beteiligung des Proteins am Byssusfaden nahelegen. Den Hauptteil der Arbeit stellt die Analyse eines der bekannten Matrixproteine dar, des Proximalen Fadenmatrixproteins 1 (PTMP1), welches zwei Von-Willebrand-Faktor Typ A-ähnliche (VWA) Domänen besitzt. Hierzu wurde zunächst die Sequenz von PTMP1 aus einer cDNA-Bank des Muschelfußes isoliert und kloniert. Anschließend erfolgte die heterologe Expression und rekombinante Produktion des Proteins und einiger davon abgeleiteten Varianten in E. coli. Da alle Proteine in Form unlöslicher bakterieller Inclusion Bodies gebildet wurden, erfolgten die Etablierung einer Reinigungs- und Rückfaltungsstrategie sowie die chromatographische Analyse und spektroskopische Charakterisierung. Dabei wies PTMP1 zwei monomere Isoformen mit unterschiedlicher Disulfidverbrückung auf. Die Kristallstruktur von PTMP1, welche die erste bekannte Kristallstruktur eines Byssusproteins darstellt, zeigte eine neuartige Anordnung der beiden VWA-Domänen, welche dabei durch einen hochgradig stabilisierten Linker verbunden sind. Ferner konnte im Kristall die Bindung zweier Zinkionen an PTMP1 nachgewiesen werden, wobei jedoch nur das MIDAS-Motiv der A1-Domäne von PTMP1, jedoch nicht das der A2-Domäne diese Bindung aufwies. Die zweite Bindestelle wurde stattdessen im Bereich des Domänenlinkers detektiert. PTMP1 wies eine außergewöhnliche strukturelle Stabilität auf, insbesondere gegenüber thermischer Denaturierung. Die zuvor postulierte Fähigkeit von PTMP1 zur Bindung von Kollagenen konnte bestätigt und vertiefend analysiert werden. Dabei zeigte sich ein signifikanter Einfluss der Bindung von der Ionenstärke, sodass von elektrostatischen Interaktionen zwischen PTMP1 und Kollagen ausgegangen werden kann. Darüber hinaus besitzt PTMP1 die Fähigkeit zur Bindung tripelhelikaler kollagenartiger Strukturen. Die geordnete Assemblierung präformierter Kollagenfibrillen erwies sich in Anwesenheit von PTMP1 als signifikant gestört. Darüber hinaus beeinflusst PTMP1 die Bildung von Fibrillen aus löslichem Kollagen, was eine Beteiligung dieses Matrixproteins an der Assemblierung der Byssuskollagene und somit einen Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften des proximalen Byssusfadenteils nahelegt.
Abstract in another language
Marine mussels of the intertidal zone like the blue mussel Mytilus galloprovincialis firmly attach to the substrate by the byssus. This holdfast apparatus consists of single threads that are, due to waves and currents, exposed to extreme mechanical challenges and, therefore, exhibit outstanding energy dissipating capacities. This property, among others, inspires many material scientists. The threads contain three morphologically distinct sections exhibiting different mechanical properties including a proximal elastic, a distal stiff portion and an adhesive plaque mediating interactions with substrates. Byssus is almost entirely composed of proteins with the prominent part being represented by fibrillar collagens, embedded in a proteinaceous matrix. Nearly all known byssal proteins exhibit a high degree of posttranslational modifications, above all the presence of 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) residues. These moieties play a key role in cohesive and adhesive capabilities of byssal proteins. Furthermore, the oxidation of DOPA residues to the respective o-quinones induces cross-linking of byssal proteins during byssus ageing and quinone tanning of the threads. This oxidation is catalyzed by a so far unknown catechol oxidase. Here, the sequence of a putative byssal catechol oxidase was identified in a mussel foot cDNA library, and the protein derived thereof was characterized by bioinformatical tools concerning potential localization and structure. The observed protein shares some characteristics with a catechol oxidase formerly extracted from the byssus by J. H. Waite. Besides a catalytic domain which exhibits homology to known catechol oxidases or tyrosinases, the putative byssal enzyme shows additional domains that suggest a structural contribution to the byssus. The main focus of the present work was the analysis of one known byssal matrix protein, Proximal Thread Matrix Protein 1 (PTMP1), which contains two von Willebrand factor type A-like (VWA) domains. The cDNA of PTMP1 was amplified from a cDNA library of the mussel foot and cloned. Next, the protein and several variants thereof were recombinantly produced in E. coli. Since the expression of all constructs lead to formation of bacterial inclusion bodies, a purification and refolding strategy was established and the refolded forms of the proteins were analyzed chromatographically and spectroscopically. Recombinant PTMP1 exhibited two monomeric isoforms that are alternatively disulfide bonded. The crystal structure of PTMP1, being the first reported crystal structure of a protein from the byssus, exhibited a novel arrangement of the two VWA domains, interconnected by a highly stabilized linker. Furthermore, two binding sites for zinc ions could be observed, one in the MIDAS-motif of the A1 domain and one in the inter-domain linker. PTMP1 exhibited an outstanding stability against thermal denaturation. The formerly postulated capacity of PTMP1 for collagen binding was confirmed and analyzed. Here, a significant influence of the ionic strength on binding was observed, suggesting electrostatic interactions between PTMP1 and collagens. Moreover, PTMP1 exhibited a capability of binding triple-helical collagenous structures. The ordered alignment of preformed collagen fibrils was dramatically interfered by PTMP1. Furthermore, PTMP1 influenced the assembly of fibrils reconstituted from soluble collagens, suggesting a contribution of PTMP1 during the assembly of collagens and, therefore, an influence of the protein on the mechanical properties of the byssal thread.
Further data
Item Type: | Doctoral thesis (No information) |
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Keywords: | Biochemie; Byssus; Rekombinantes Protein; Rückfaltung; Catecholoxidase; Matrixprotein; VWA-Domäne; Disulfidbrücke |
DDC Subjects: | 500 Science > 570 Life sciences, biology |
Institutions of the University: | Graduate Schools > Bayreuth Graduate School of Mathematical and Natural Sciences (BayNAT) Graduate Schools |
Language: | German |
Originates at UBT: | Yes |
URN: | urn:nbn:de:bvb:703-opus4-14316 |
Date Deposited: | 24 Apr 2014 14:30 |
Last Modified: | 11 Dec 2015 08:27 |
URI: | https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/95 |