Title data
Jampani, Nageswara Rao:
NMR Studies on Termination/- Antitermination Complexes of HIV-1 Transcription.
Bayreuth
,
2006
(
Doctoral thesis,
2006
, University of Bayreuth, Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences)
|
|||||||||
Download (6MB)
|
Abstract
After HIV enters the host cell the viral RNA is reverse transcribed into double stranded DNA and then integrated into the host genome. At this step, transcription of HIV RNA by Rpol II is tightly regulated by several cellular factors including NELF, DSIF, and pTEFb, and the virus encoded Tat protein. The work presented in this thesis is mainly focussed on understanding the mechanism of termination and antitermination of HIV-1 transcription. Some of the cysteines in the wild type HIV-1 Tat are required for the Zn2+ dependent interaction with pTEFb, but not needed for the binding of TAR RNA in vitro. These cysteines are readily oxidised and leading to the protein aggregation. Thus, a mutant, Tat-Cys-, lacking all cysteines was used for binding studies with TAR RNA. 1H-15N HSQC and 1H-1H TOCSY spectra were measured to monitor the interaction between Tat-Cys- and TAR RNA. The results presented indicate Tat-Cys- is binding to TAR RNA around the bulge region and is able to induce a conformational change in TAR RNA. This is further supported by observing a change in the CD signal at 265 nm upon addition of Tat-Cys- to TAR RNA. {1H}-15N steady state NOE experiments showed that the core region of Tat remains unstructured even in the complex with TAR RNA. Based on the NMR and CD spectroscopic data presented in this thesis, and data published by others it is tempting to speculate that the core and basic regions of Tat-Cys- remain unstructured upon binding to TAR RNA. Furthermore, the solution structure of the RNA binding domain of NELF-E, NELF-E RRM, was determined using multidimensional NMR spectroscopy. The data reveal that the structure of NELF-E RRM exhibits a babbab topology. The atomic coordinates were deposited in the protein data bank (pdb) under the accession code 2BZ2. RNA binding studies were performed with TAR RNA and various oligoribonucleotides. NMR studies with NELF-E RRM:TAR complexes indicate NELF-E RRM binds to various RNAs in a very similar manner but with different affinities. Mapping of chemical shift perturbations on the structure of NELF-E RRM indicate that the RNA binding interface is mainly located on the b-sheet surface. Large chemical shift perturbations are observed for the residues located in the flexible C-terminal region of NELF-E RRM and in the loop between b3 and a2. Among the various RNAs tested, TAR49-57 displayed the highest affinity to NELF-E RRM. Further structural characterisation of the NELF-E RRM:TAR49-57 complex revealed that the C-terminal region of NEFL-E RRM adopts a small 310 helix around the b3-a2 loop and is stabilised by several hydrophic interactions. The C-terminal region of NELF-E RRM in the RNA bound conformation is very close to the RNA binding interface and could be involved in the RNA binding. However, further structural characterisation of NELF-E RRM in the complex with RNA will be needed to fully understand the mechanism of RNA recognition.
Abstract in another language
Nachdem HIV in die Wirtszelle eingetreten ist, wird die virale RNA durch Reverse Transkription in doppelsträngige DNA umgewandelt und anschließend ins Wirtsgenom integriert. Ab diesem Zeitpunkt wird die Transkription der HIV RNA durch die Rpol II streng durch verschiedene zelluläre Faktoren, wie NELF, DSIF und pTEFb, sowie durch das virale Tat Protein reguliert. Die Ergebnisse, die in dieser Arbeit präsentiert werden, konzentrieren sich hauptsächlich auf das Verständnis des Mechanismus der Termination und Antitermination der HIV-1 Transkription. Einige der Cysteine des Wildtyp Tat Proteins sind für die Zn2+ abhängige Wechselwirkung mit pTEFb erforderlich. Allerdings werden sie für die Bindung von Tat an die TAR RNA in vitro nicht benötigt. Deswegen wurde eine Mutante, Tat-Cys-, der alle Cysteine fehlen, für Bindungsstudien mit TAR RNA verwendet. Um die Wechselwirkung von Tat-Cys- mit TAR zu analysieren, wurden 1H-15N HSQC und 1H-1H TOCSY Spektren gemessen. Die dargestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass Tat-Cys- an die Bulge Region (Ausbuchtung) der TAR RNA bindet, und dass das Protein in der Lage ist, Konformationsänderungen in der TAR RNA herbeizuführen. Dieses Ergebnis wird durch den Befund einer Änderung des CD-Signals bei 265 nm nach Zugabe von Tat-Cys- zur TAR RNA weiter unterstützt. {1H}-15N steady state NOE Experimente zeigen, dass die Kernregion (core) von Tat auch im Komplex mit der TAR RNA unstrukturiert bleibt. Auf der Grundlage der in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse und der Ergebnisse anderer Gruppen kann man annehmen, dass die Kernregion und die basische Region von Tat-Cys- nach der Bindung an TAR RNA unstrukturiert bleiben. Darüber hinaus wurde die Struktur der RNA-bindenden Domäne von NELF-E, NELF-E RRM, mit Hilfe multidimensionaler NMR Spektroskopie in Lösung bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Struktur von NELF-E RRM eine babbab Topologie aufweist. Die Atom-Koordinaten wurden in der Proteindatenbank (pdb) unter der Eintragsnummer 2BZ2 hinterlegt. Es wurden RNA Bindungsstudien mit der TAR RNA und verschiedenen Oligoribonukleotiden durchgeführt. NMR Studien mit NELF-E RRM:TAR Komplexen zeigen, dass NELF-E RRM verschiedene RNAs in ähnlicher Weise, jedoch mit unterschiedlichen Affinitäten, bindet. Die Kartierung der Änderung der chemischen Verschiebungen auf der Struktur von NELF-E RRM zeigen, dass sich die RNA Bindungsfläche hauptsächlich auf der Oberfläche des b-Faltblatts befindet. Große Änderungen der chemischen Verschiebungen können für die Reste in der flexiblen C-terminalen Region von NELF-E RRM und in der Schleife zwischen b3 und a2 beobachtet werden. Unter den verschiedenen getesteten RNAs besaß TAR49-57 die höchste Affinität für NELF-E RRM. Zusätzliche strukturelle Charakterisierungen zeigten, dass die C-terminale Region von NELF-E RRM eine kleine 310 Helix in der Region der b3-a2-Schleife ausbildet und durch verschiedene hydrophobe Wechselwirkungen stabilisiert wird. Die C-terminale Region von NELF-E RRM befindet sich in der RNA-gebundenen Form sehr nahe an der RNA Bindungsfläche und könnte in der RNA Bindung beteiligt sein. Allerdings ist eine weitere Charakterisierung von NELF-E RRM im Komplex mit RNA notwendig um den Mechanismus der RNA Erkennung vollständig aufzuklären.
Further data
Item Type: | Doctoral thesis (No information) |
---|---|
Keywords: | HIV; Genregulation; Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie; RNS-Bindungsproteine; Antitermination; Tat-Protein; eukaryotic negativer Elongationsfaktor (NELF); RNS Erkennungs motiv (RRM); TAR-RNS; NMR-Struktur; Tat protein; Eukaryotic negative elongation factor (NELF); RNA recognition motif (RRM); TAR RNA; NMR structure |
DDC Subjects: | 500 Science > 540 Chemistry |
Institutions of the University: | Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry Faculties Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences |
Language: | English |
Originates at UBT: | Yes |
URN: | urn:nbn:de:bvb:703-opus-2535 |
Date Deposited: | 25 Apr 2014 12:42 |
Last Modified: | 25 Apr 2014 12:42 |
URI: | https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/773 |