Title data
Wunderlich, Michael:
Thermodynamische Stabilisierung von Proteinen durch in vitro Evolution und biophysikalische Analyse ihrer molekularen Grundlagen.
Bayreuth
,
2006
(
Doctoral thesis,
2006
, University of Bayreuth, Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences)
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Abstract
Proteine sind zentrale Bausteine des Lebens und ihre dreidimensionale Struktur ist für die Funktion von entscheidender Bedeutung. Deswegen ist das Verständnis der konformationellen Stabilität von Proteinen von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde das Selektionssystem Proside zur Stabilisierung von Proteinen genutzt. Proside basiert auf der phage display Technologie und verknüpft die thermodynamische Stabilität von Proteinen mit der Infektiosität von filamentösen Phagen. Die bakteriellen Kälteschockproteine werden sowohl von experimenteller, als auch theoretischer Seite als Modellproteine zur Untersuchung der Stabilität von Proteinen genützt. Es ist bekannt, dass elektrostatische Wechselwirkungen auf der Oberfläche von sehr großer Bedeutung für ihre Stabilität sind. Deswegen sollte versucht werden, alternative Ladungsnetzwerke auf der Oberfläche des Kälteschockproteins Bs-CspB aus B. subtilis unter Verwendung von in vitro Evolution zu etablieren. Zu diesem Zweck wurden Reste anhand von Sequenz- und Strukturvergleichen mit homologen Proteinen ausgewählt und diese Positionen partiell randomisiert. In einem zweiten Ansatz wurden zufällig Mutationen in das Gen von Bs-CspB eingeführt. Nach erfolgter in vitro Evolution der jeweiligen Bibliotheken konnten an sechs oberflächenexponierten Positionen stabilisierende Mutationen identifiziert werden. Die Beiträge dieser Mutationen zur thermodynamischen Stabilität von Bs-CspB wurden analysiert. Die beste Kombination war, mit einem Schmelzpunkt von 83,7°C im Vergleich zu 53,8°C vom Wildtypprotein, sogar stabiler war als das hyperthermophile Homologe Tm-Csp aus T. maritima. Einen beachtlichen Beitrag zu dieser deutlichen Stabilisierung liefern dabei verbesserte Coulomb´sche Wechselwirkungen. Die Beiträge sind dabei jedoch sehr stark von der Umgebung abhängig. Vergleiche der experimentellen Daten mit vorhandenen theoretischen Betrachtungen offenbarten die Schwierigkeiten, Coulombsche Wechselwirkungen auf der Proteinoberfläche korrekt zu berechnen und deren Einfluss auf die thermodynamische Proteinstabilität zu bestimmen. Ein theoretischer Ansatz, welcher unter Verwendung eines quasi-elektrischen Dipolmomentes die Einflüsse von Veränderungen der Ladungsverteilung auf die Stabilität vorhersagte, konnte experimentell nicht verifiziert werden. Ebenso konnten keine Korrelationen zwischen Veränderungen der Stabilität und der Nettoladung des Proteins festgestellt werden und auch keine Korrelation mit der Bildung von Ionenpaaren hergestellt werden. Ebenso wie Bs-CspB stellt auch die b1 Domäne des Streptokokkenproteins G ein Modellprotein zur Untersuchung von thermodynamischer Stabilität dar. In der Gruppe von S. Mayo wurde dieses Protein unter Verwendung von computational design untersucht. Dabei zeigte sich, dass die vier teilweise exponierten Reste ein sehr großes Stabilisierungspotential besitzen. Eine in vitro Evolution dieser vier Positionen durch das Selektionssystem Proside bot somit die Möglichkeit, die Leistungsfähigkeit der beiden Methoden direkt zu vergleichen. Die Selektionen lieferten eine Vielzahl von deutlich stabilisierten Proteinvarianten. Für die stabilste Variante war der Mittelpunkt des thermischen Überganges um 24,7°C erhöht. Die beste Variante aus dem computational design lag von allen untersuchten Varianten auf dem dritten Platz. Sieben der zehn berechneten Varianten, welche in den Kalkulationen alle annähernd gleich stabil waren, enthielten einzeln oder in Kombination die Aminosäurereste L18 und K29. Diese beiden Reste erwiesen sich bei der experimentellen Charakterisierung als sehr ungünstig. Um die Ursachen für diese Unterschiede zu ergründen, wurde von zwei Varianten die dreidimensionale Struktur bestimmt. Zusätzlich wurden die enthaltenen Mutationen einzeln und in unterschiedlicher Kombination thermodynamisch charakterisiert. Dabei zeigten sich bei der Analyse die Schwierigkeiten, strukturelles Verhalten in experimentelle energetische Terme zu übersetzen, was der Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse bei der Stabilisierung durch in vitro Evolution und computational design sein dürfte. Im Folgenden sollten für beide Schritte auf dem Weg zur Stabilisierung, der Auswahl von Positionen und dem Finden der besten Aminosäurereste, ein experimentelles Herangehen genützt werden. Durch Selektion von Bibliotheken mit zufälligen Mutationen, erstellt mittels fehlerhafter PCR, konnten viel versprechende Positionen identifiziert werden. Diese wurden dann einer Sättigungmutagenese mit anschließender Selektion unterworfen und die gefundenen Mutationen der beiden stabilsten Varianten wurden abschließend manuell kombiniert. Die erhaltene Variante besaß einen um 35,1°C erhöhten Übergangsmittelpunkt. Bei der Analyse der Ursachen zeigte sich, dass in diesem Fall starke hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den durch diese Mutationen eingeführten Seitenketten wirken. Dies zeigt, dass zur Stabilisierung von Proteinen vielfältige Wege beschritten werden können.
Abstract in another language
Proteins are central building blocks of life and their three dimensional structure is of utmost importance for the function. Therefore the understanding of conformational protein stability is of high scientific as well as commercial interest. In this work the selection system Proside was used to stabilize proteins. Proside is based on the phage display technology linking the thermodynamic stability of proteins with the infectivity of filamentous phages. The bacterial cold shock proteins were investigated by both experimentalists and theoreticians as a model system for protein stability. It is known that electrostatic interactions at the surface of the cold shock proteins are important for their stability. The first aim was to establish alternative charge networks at the surface of Bs-CspB from B. subtilis to stabilize the protein. Nine residues were chosen by sequence and structure alignments of homologous proteins and these positions were partially randomized. In a second approach, random mutations were introduced into the gene of Bs-CspB By in vitro evolution of the corresponding phage libraries six stabilizing mutations were found at the surface positions. The contributions of these mutations to the thermodynamic stability were characterized by analyzing them individually and in combination. The best combination increased the midpoint of thermal unfolding of Bs-CspB from 53.8°C to 83.7°C, which implies that the corresponding mutant more stable than the homologous cold shock protein from the hyperthermophilic bacterium T. maritima. A significant contribution to this stabilization is provided by improved coulombic interactions. But the effects of most mutations are strongly context dependent. Comparisons of the experimental data and existing theoretical investigations show the difficulty to calculate the coulombic interactions at the surface of proteins and to determine their influence on the thermodynamic stability of proteins. The quasi-electric dipole moment, which is used in a theoretical approach to predict the influence of a change in charge distribution to protein stability, could not be validated by experiment. The stabilizations by charge mutations did not correlate well with the corresponding changes in the protein net charge, and they could also not be ascribed to the formation of ion pairs. Therefore it remains a challenging task to correctly predict electrostatic interactions at the surface of proteins and to calculate their contribution to the Gibbs free energy of unfolding. Similar to the cold shock protein, the b1 domain of the streptococcal protein G is a widely used model protein for investigations of the thermodynamic stability of proteins. In the group of S. Mayo this protein was used for sequence optimization by computational design. It could be shown that four partially exposed (“boundary”) positions carry a large potential for stabilization. The in-vitro evolution of the same four positions by the selection system Proside offered the possibility to compare the efficiency of both methods directly. Many Gb1 variants with strongly increased thermal stabilities were found in the selections. For the most stable variant the midpoint of the thermal transition was increased by 24.7°C. The best variant from the calculations ranked third within the panel of the selected variants. Seven of the ten nearly isoenergetic variants from the calculations contained the residues L18 and K29 individually or in combination. These two residues turned out to be less favorable in the experimental characterization. To elucidate the reasons for these differences, the threedimensional structures of two variants were determined. The peptide backbone of these variants was almost unchanged in comparison to the wildtype protein. Additionally, the mutations containing in these variants were thermodynamically characterized, individually and in different combinations. The structure/stability comparisons emphasized how difficult it is to translate structural behaviour into experimental energetic terms. This is probably the reason for the differences between the results of in vitro evolution and computational design. In the first stabilization of Gb1 for identification of interesting positions the results of the computational design were used. In a second approach the experimental in-vitro selection system Proside was used for both identifying promising sites (in libraries of Gb1 mutants that were created by error-prone PCR) and obtaining the best residues (in libraries created by saturation mutagenesis at these sites). A manual combination of the two most stable selected variants resulted in the hyperstable fourfold mutant, which showed an increase in the midpoint of the thermal transition of 35.1°C. The analysis of the reasons showed, that strong hydrophobic interactions are acting between the aminoacids introduced by these mutations. This shows, that there are many different approaches to stabilize a protein.
Further data
Item Type: | Doctoral thesis (No information) |
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Keywords: | Proteinfaltung; Gerichtete Evolution; Kälteschock-Proteine; Proteindesign; Thermodynamische Stabilität; Gb1; Proside; CspB; Phagendisplay; Proteinstabilität; protein stability; Proside; phage display; protein design; protein folding |
DDC Subjects: | 500 Science > 570 Life sciences, biology |
Institutions of the University: | Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry Faculties Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences |
Language: | German |
Originates at UBT: | Yes |
URN: | urn:nbn:de:bvb:703-opus-2581 |
Date Deposited: | 25 Apr 2014 12:41 |
Last Modified: | 25 Apr 2014 12:41 |
URI: | https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/768 |