Title data
Kather, Insa:
Stabilisierung von Proteinen durch in vitro-Evolution - Selektion und biophysikalische Charakterisierung.
Bayreuth
,
2007
(
Doctoral thesis,
2007
, University of Bayreuth, Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences)
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Abstract
Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, große Proteine bzw. Enzyme durch Proside zu stabilisieren und die selektierten Varianten biophysikalisch zu charakterisieren. Proside ist eine auf dem phage display basierende in vitro-Evolutions-Methode zur Selektion stabilisierter Proteinvarianten, wobei eine erhöhte Proteaseresistenz stabilisierter Proteinvarianten mit der Infektiosität filamentöser Phagen verknüpft wird. Die evolutive Stabilisierung großer Proteine bzw. Enzyme ist besonders wichtig, weil deren Optimierung mittels rationalen Designs aufgrund der fehlenden Kenntnis der Struktur-Stabilitäts-Zusammenhänge fast unmöglich ist. Zum einen sind stabilisierte Enzyme in der industriellen Anwendung von großem Interesse, zum anderen ermöglicht die Analyse der stabilisierenden Effekte, vor allem auch im strukturellen Zusammenhang, Einblicke in die Prinzipien der Stabilität von Mehr-Domänen-Proteinen. Im Proside-System wird das zu stabilisierende Gastprotein zwischen die N2- und die CT-Domäne des G3P filamentöser Phagen eingebaut. Proside ist ein sehr effektives Selektionssystem, die Stabilisierung größerer Gastproteine ist jedoch schwierig. Cysteinhaltige Gastproteine können mit den Disulfidbrücken des G3P inkorrekte Disulfidbrücken bilden, wodurch die Infektiosität der Phagen verlorengeht. Außerdem nimmt die Infektiosität der Phagen mit der zunehmenden Größe des Gastproteins ab. Dieses Phänomen tritt besonders in Kombination mit dem Problem des Verlusts von Gastproteinen durch homologe Rekombination in Erscheinung. Phagen, die durch Rekombination das Gastprotein verlieren, sind in der in vitro-Proteolyse stark begünstigt und zusätzlich auch infektiöser als Phagen mit dem vollständigen Gastproteininsert. Ziel der Arbeit war deshalb zunächst, das Selektionssystem so zu modifizieren, dass es auf größere Proteine angewendet werden kann. Um das Problem der inkorrekten Disulfidverbrückung zu eliminieren, wurden die drei Disulfidbrücken im N1N2-Fragment des G3P durch Proside-Selektion substituiert und damit ein infektiöser Phage mit disulfidfreiem G3P konstruiert. Das selektierte 0SS-G3P* ist stabiler als das disulfidverbrückte Wildtyp-Protein. Kombination aller selektierten Mutationen in einer Variante ergibt ein im Vergleich zum Wildtyp-Protein um 19,0 °C stabilisiertes disulfidfreies G3P*. Die 14 second-site Muationen konnten so den Verlust von drei Disulfidbrücken überkompensieren. Die Einzelbeiträge zur Stabilisierung wurden mit Hilfe vieler Einzel- und Mehrfachmutanten charakterisiert und auf der Basis der Kristallstruktur des stabilisierten 0SS-G3P* analysiert. Dies ergab, dass verbesserte Domäneninteraktionen einen enormen Beitrag zur Stabilität leisten. Das G3P besitzt neben den Domänen N1 und N2 eine C-terminale Domäne CT, die auch für den Infektionsprozeß von Bedeutung ist. Diese Domäne wurde allein oder in Fusion mit N2 bzw. N1 und N2 exprimiert. Die isolierte CT-Domäne ist bis auf eine hydrophobe Helix entfaltet. Lediglich in Gegenwart von N1 und N2 besitzt sie eine marginale konformationelle Stabilität. Die Funktion der CT-Domäne bei Infektion und Phagenaustritt aus der Wirtszelle beruht auf der Exponierung hydrophober Oberflächen für die Interaktion mit der Wirtszellmembran, so dass eine flexible bzw. nur marginal stabile Domäne hierfür sehr geeignet scheint. Als Modellprotein für große Enzyme wurde die TEM-1 Beta-Lactamase aus E. coli durch Zufallsmutagenese und Proside-Selektion stabilisiert. Ebenso wie im Fall des G3P wurde eine große Stabilisierung des Enzyms um 18,4 °C durch eine stufenweise Selektion und anschließende Kombination der stabilisierenden Mutationen erreicht. Die stabilisierte Kombinationsvariante ist bei niedriger Temperatur etwa doppelt so aktiv wie das Wildtyp-Protein, und das Optimum der Aktivität ist zu höheren Temperaturen verschoben. Die Selektion stabilisierter Varianten war nur bei gleichzeitiger Selektion auf Ampicillin-Resistenz der infizierten Zellen möglich. Da der Phagentiter niedrig war, dominierten in Abwesenheit von Ampicillin rekombinante Phagen ohne Gastprotein die in vitro- und in vivo-Selektion. Um dieses Problem bei großen Gastproteinen ausschließen zu können, wurde ein alternatives Selektionssystem etabliert, wobei das zu stabilisierende Gastprotein aus der ursprünglichen Position zwischen der N2- und der CT-Domäne an den Beginn des G3P verschoben und mit einem N-terminalen Cystein als Selektions-Tag versehen wird. Die Phagenbibliothek wird auch in diesem Fall einer Proteolyse unterworfen, die Selektion beruht jedoch nicht auf einer Kombination von Proteaseresistenz und Infektiosität des Phagen, sondern auf der Kombination Proteaseresistenz und Bindung an eine Affinitätsmatrix. Die Infektiosität der Phagen wird durch ein N-terminal angefügtes Gastprotein nicht beeinflußt, und in ersten Selektionsversuchen mit Beta-Lactamase konnten stabilisierte Varianten angereichert werden.
Abstract in another language
The aim of the thesis was the application of Proside to stabilize large proteins or even enzymes and to characterize the selected variants with biophysical methods. Proside is an in-vitro evolution method for the selection of stabilized protein variants based on phage display. It combines an increased protease resistance of stabilized protein variants with the infectivity of a filamentous phage. The stabilization of larger proteins or enzymes would be of great interest as this cannot be achieved by rational design because of the lack of knowledge of the structure-stability-relationship. On the one hand, stabilized enzymes are of major industrial importance, on the other hand the analysis of the stabilizing effects gives insight into the principles of protein stability in multi-domain proteins. In Proside, a library of the protein to be stabilized is inserted between the N2 and the CT domain of the gene-3-protein (G3P) of filamentous phage. Proside is difficult to apply to larger proteins. Cysteine-bearing guest proteins often form incorrect disulfide bonds with the disulfides of the G3P, resulting in the loss of infectivity of the corresponding phage. Furthermore, the infectivity of the phage decreases when the size of the guest protein increases. This phenomenon is linked with the loss of the guest protein by homologous recombination. Recombinant phage without a guest protein have an advantage in both the in-vitro proteolysis and the subsequent infection step. Thus, the recombinant phage become enriched in the library. Therefore, the selection system must be tailored to accommodate to large proteins. To avoid the problem of incorrect disulfide bonds between G3P and the guest protein the three disulfides in the G3P N1N2 fragment were substituted by Proside selection to generate an infectious phage with a stable disulfide-free G3P. This was accomplished by a stepwise approach. Manual combination of all the stabilizing mutations leads to a 0SS-G3P* variant which is 19.0 °C more stable than the wild-type protein. The 14 second-site mutations thus overcompensate by far the loss of the three disulfides. The stabilizing effects of the single mutations were characterized by the analysis of a large number of single and combinatorial mutants and by the structure-based analyses of the 0SS-G3P*. These considerations reveal an enormous contribution of optimized domain interactions to stability. Intradomain stabilization is achieved by additional electrostatic interactions as well as improved hydrophobic interactions. In addition to domains N1 and N2, G3P consists of the C-terminal domain CT which is also important for the infection process. This domain was expressed in isolation or in combination with either N2 or N1 and N2. The isolated CT domain is unfolded, except for a hydrophobic helix. Only in the presence of both N1 and N2, CT adopted a marginally stable folded conformation. The function of the CT domain in the infection mechanism and for phage release from the host cell is based on the exposure of hydrophobic surface. Therefore, a flexible or marginally stable domain might be well suited to fulfill these requirements. As a model protein for large enzymes, the TEM-1 Beta-lactamase of E. coli was stabilized by random mutagenesis and Proside selection. As well as for the G3P, a strong stabilization of the enzyme by 18.4 °C was achieved by a stepwise selection strategy followed by the combination of the stabilizing mutations. The Beta-lactamase with all stabilizing mutations is twice as active as the wild-type protein at low temperatures, and the optimum of the activity is shifted to higher temperature. The selection of stabilized beta-La-variants could be achieved because only the phage with functional beta-La inserts would propagate in the presence of ampicillin. The phage titer was low, and in the absence of ampicillin recombinant phage without guest protein dominated both the in-vitro and the in-vivo selection. An alternative selection system was therefore developed for large proteins. The protein to be stabilized is shifted from the position between the domains N2 and CT to the N-terminus of the G3P and combined with an N-terminal cysteine as a selection-tag. The corresponding phage library is treated with a protease, as in the case of Proside. However, in this system the selection is not based on the combination of protease resistance and infectivity of the corresponding phage but on the combination of protease resistance and binding to thiol-sepharose. The infectivity of the phage is not influenced by an N-terminally fused guest protein, and first experiments with Beat-lactamase led to the selection of stabilized variants.
Further data
Item Type: | Doctoral thesis (No information) |
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Keywords: | Disulfidbrücke; Thermodynamische Stabilität; Lactamase <beta->; in vitro-Evolution; Gen-3-Protein; in-vitro evolution; gene-3-protein; disulfide bond; thermodynamic stability; beta-lactamase |
DDC Subjects: | 500 Science |
Institutions of the University: | Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry Faculties Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences |
Language: | German |
Originates at UBT: | Yes |
URN: | urn:nbn:de:bvb:703-opus-3547 |
Date Deposited: | 25 Apr 2014 11:29 |
Last Modified: | 25 Apr 2014 11:29 |
URI: | https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/681 |