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Mechanistische Untersuchungen zur Regulation der bakteriellen Transkription durch NusG-Proteine

DOI zum Zitieren der Version auf EPub Bayreuth: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00005246
URN to cite this document: urn:nbn:de:bvb:703-epub-5246-3

Title data

Zuber, Philipp:
Mechanistische Untersuchungen zur Regulation der bakteriellen Transkription durch NusG-Proteine.
Bayreuth , 2023 . - VI, 223 P.
( Doctoral thesis, 2020 , University of Bayreuth, Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences)

Project information

Project title:
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Project's id
Transcription in E. coli: Structural Basis of Nus-Factor Dependent Regulation
Ro 617/17-1
Die Regulation bakterieller RNA Polymerase durch Transkriptionsfaktoren
Ro 617/21-1

Project financing: Deutsche Forschungsgemeinschaft

Abstract

Die Transkription ist als erster Schritt der Genexpression ein zentraler Prozess in allen Organismen. Katalysiert wird sie durch RNA-Polymerasen (RNAPs), die von zahlreichen Transkriptionsfaktoren reguliert werden, von denen die NusG- (Bakterien) bzw. Spt5- (Archaeen, Eukaryoten) Proteine die einzige universell konservierte Klasse darstellen. NusG besteht aus mindestens zwei flexibel verbundenen Domänen (N-/C-terminale Domäne, NTD/CTD), wobei die NusG-CTD auch als KOW-Domäne bezeichnet wird und eine beta-Fass-Struktur besitzt. In Escherichia coli (E. coli) bindet die NusG-NTD an die RNAP und erhöht deren Prozessivität, während die NusG-CTD unterschiedlichste Interaktionspartner hat. Daneben existieren spezialisierte NusG-Paraloge, wie E. coli RfaH, das spezifisch an Operons rekrutiert wird, die ein operon polarity suppressor (ops)-Element enthalten. Auch RfaH besteht aus einer NTD und einer CTD, die flexibel verbunden sind. Während die RfaH-NTD strukturell und funktionell homolog zur NusG-NTD ist, faltet sich die RfaH-CTD als alpha-hairpin und interagiert mit der RfaH-NTD, womit sie deren RNAP-Bindestelle maskiert und RfaH so autoinhibiert. Bei Rekrutierung an einen durch ops pausierten Elongationskomplex (ops-PEC) wird die Domäneninteraktion aufgehoben, die RfaH-NTD bindet an die RNAP und die isolierte RfaH-CTD faltet sich in ein NusG-CTD-ähnliches beta-Fass um, das mit S10 interagieren und so die Translation aktivieren kann. Da die Basis der Transkriptionsregulation durch NusG/Spt5 und RfaH noch immer zu großen Teilen unverstanden ist, wurden in dieser Arbeit die zugrundeliegenden Prinzipien auf molekularer Ebene durch Kombination von integrativer Strukturbiologie mit biophysikalischen und biochemischen Methoden untersucht. RfaH-kontrollierte Gene enthalten ein ops-Element, das im ops-PEC an der Oberfläche der RNAP zugänglich ist und von RfaH erkannt wird. Um die Basis für diese spezifische Erkennung zu untersuchen, wurde die Struktur des RfaH:ops-Komplexes bestimmt. Die ops-DNA bildet einen hairpin, wodurch die zentralen Basen des Motivs exponiert werden und eine spezifische Interaktion mit RfaH ermöglichen. Dies stellt einen neuen Modus der spezifischen Erkennung einzelsträngiger DNA dar. In-vitro-Transkriptionsassays zeigten zudem, dass die flankierenden ops-Nukleotide essenziell zur Einführung der Transkriptionspause sind. Das ops-Element stellt somit ein chimäres Pausierungs- und Rekrutierungssignal dar. Mittels für supramolekulare Systeme geeigneten Kernspinresonanz (NMR)-Methoden wurde der molekulare Auslöser für die Umfaltung der RfaH-CTD identifiziert. Weder die isolierte ops-DNA noch die isolierte RNAP können die Domänendissoziation und damit die Umfaltung der RfaHCTD induzieren; hierzu ist ausschließlich der ops-PEC in der Lage. Weiterhin wurde gezeigt, dass ops-PEC-gebundenes RfaH mit S10 interagieren kann, was die Grundlage für die Aktivierung der Translation ist, und dass RfaH nach Dissoziation von der RNAP wieder in den autoinhibierten Zustand zurückfaltet. RfaH agiert somit in einem geschlossenen Funktionszyklus. Auch die NusG-CTD bindet an S10 und könnte so die RNAP mit dem Ribosom verbrücken. Mittels supramolekularer NMR-Methoden wurde hier erstmals eine direkte, simultane Interaktion zwischen der RNAP, NusG und dem 70S-Ribosom demonstriert werden, was die strukturelle Basis für die NusG-vermittelte Transkriptions:Translations-Kopplung darstellt. In-vivo-Experimente ergaben zudem, dass NusG erst spät während der Transkription rekrutiert wird und dass dies von der Translation abhängt. Eukaryotische Spt5-Proteine enthalten 5-7 KOW-Domänen. Da nur wenige Daten über die KOW-Domänen 4, 6 und 7 des humanen Spt5 vorlagen, wurden deren Strukturen bestimmt. Die KOW4 faltet als beta-Fass, das von weiteren Strukturelementen flankiert wird. Letztere ermöglichen eine Interaktion mit Nukleinsäuren und dem Rpb4/7-stalk der RNAP-II, und erweitern so das funktionelle Repertoire der KOW-Domänen. KOW6 und 7 bilden ein Doppel-beta-Fass, dessen Funktion jedoch noch unbekannt ist. Die RfaH-CTD nimmt eine Sonderstellung unter allen bisher bekannten NusG/Spt5-KOW-Domänen ein, da sie einen vollständigen und reversiblen Faltungswechsel vollzieht. Um die zugrundeliegenden Prinzipien aufzuklären, wurden Stabilitäts- und Strukturdynamikstudien mit isolierten CTDs/KOW-Domänen von NusG/RfaH-Proteinen aus allen drei Domänen des Lebens durchgeführt. Diese ergaben, dass die RfaH-CTD thermodynamisch instabiler als die meisten anderen Domänen ist, weshalb sie im Gleichgewicht mit einer ungefalteten Spezies steht. Letztere weist jedoch helikale Reststrukturen auf und ist somit ein potenzielles Intermediat zwischen den beiden RfaH-CTD-Zuständen, was die Basis für die konformationelle Plastizität von RfaH darstellt. Somit erweitern die Ergebnisse dieser Arbeit nicht nur das Verständnis der Transkriptionsregulation durch NusG-Proteine, sondern gewähren Einblicke in die molekularen Grundlagen neuer regulatorischer Prinzipien und der Proteinfaltung.

Abstract in another language

As transcription is the first step in gene expression, it constitutes a central process in all organisms. It is catalyzed by RNA polymerases (RNAPs), which are regulated by a plethora of transcription factors, of which NusG (bacteria) / Spt5 (archaea, eukaryotes) proteins make up the only universally conserved class. NusG consists of at least two flexibly connected domains: an N-terminal domain (NTD) and a C-terminal domain (CTD), the latter being also referred to as KOW domain and exhibiting a beta-barrel topology. In Escherichia coli (E. coli), the NusG-NTD binds to RNAP and increases transcription processivity, whereas the NusG-CTD has various interaction partners. Additionally, several specialized NusG paralogs exist, such as E. coli RfaH, which is specifically recruited to operons containing an operon polarity suppressor (ops) element. Like NusG, RfaH also consists of an NTD and a CTD, which are flexibly linked. RfaH-NTD is structurally and functionally homologous to NusG-NTD. In contrast, the RfaH-CTD folds as alpha-hairpin and interacts with the RfaH-NTD, thereby masking the RNAP binding site of RfaH-NTD, and thus autoinhibiting RfaH. When RfaH is recruited to an elongation complex paused at an ops site (ops-PEC), the domains dissociate, RfaH-NTD binds to RNAP, and the isolated RfaH-CTD refolds into a NusG-CTD-like beta-barrel that interacts with S10 to activate translation. Since the basis of transcription regulation by NusG/Spt5 and RfaH is still widely unknown, this thesis investigated the underlying principles at a molecular level using a combination of integrative structural biology, biophysical, and biochemical methods. RfaH-controlled genes contain an ops element that is exposed at the surface of the RNAP in the ops-PEC and that is recognized by RfaH. To investigate the basis for this specific recognition, the structure of the RfaH:ops complex was determined. The ops DNA forms a hairpin, which flips out the central bases of this element to allow specific interaction with RfaH. This represents a new mode of sequence-specific readout of single-stranded DNA. In vitro transcription assays further showed that the flanking ops nucleotides are essential for pausing. The ops element thus represents a chimeric pause and recruitment signal. Using nuclear magnetic resonance (NMR) methods adapted to supramolecular systems, the molecular trigger for RfaH-CTD refolding was identified. Neither the isolated ops DNA nor the isolated RNAP can induce domain dissociation and RfaH-CTD refolding; only the ops-PEC is capable of activating RfaH. Furthermore, it was shown that ops-PEC-bound RfaH can interact with S10, which is the structural basis for translation activation, and that RfaH refolds into its autoinhibited state after dissociation from RNAP. RfaH thus acts in a closed functional cycle. NusG-CTD also binds to S10 and could thus bridge RNAP and the ribosome. Using supramolecular NMR methods, a direct, simultaneous interaction between the RNAP, NusG and the 70S ribosome was demonstrated here for the first time, which represents the structural basis for NusG-mediated transcription:translation coupling. Additionally, in vivo experiments revealed that NusG is recruited late during transcription and that its recruitment depends on translation. Eukaryotic Spt5 proteins contain 5-7 KOW domains. Since only little data was available on the KOW domains 4, 6 and 7 of human Spt5, their structures were determined. The KOW4 domain folds as beta-barrel that is flanked by further structural elements. The latter enable interaction with nucleic acids and the Rpb4/7 stalk of RNAP-II, extending the functional repertoire of the KOW domains. The KOW6 and 7 domains form a double beta-barrel, the function of which is, however, still unknown. In stark contrast to all known NusG/Spt5-KOW domains, RfaH-CTD performs a complete and reversible conformational change. In order to elucidate the principles underlying the fold switch, stability and structural dynamics studies were performed with isolated CTDs/KOW domains of NusG/RfaH proteins from all three domains of life. These experiments revealed that the RfaH-CTD is thermodynamically less stable than most of the other domains, and is thus in equilibrium with an unfolded species. The latter, however, exhibits residual helical structures and is therefore a potential intermediate between the two RfaH-CTD states, which is the basis for the conformational plasticity of RfaH. Thus, the results of this work not only broaden the understanding of transcriptional regulation by NusG proteins, but also provide insights into the molecular basis of new regulatory principles and protein folding.

Further data

Item Type: Doctoral thesis (No information)
Keywords: Bakterielle Transkription; NusG-Proteine; NusG; Spt5; RfaH; NMR-Spektroskopie; Faltungswechselnde Proteine; Proteinfaltung
DDC Subjects: 500 Science > 530 Physics
500 Science > 540 Chemistry
500 Science > 570 Life sciences, biology
Institutions of the University: Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry > Former Professors > Chair Biopolymers - Univ.-Prof. Dr. Paul Rösch
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry > Former Professors > Chair Biopolymers - Apl. Prof. Dr. Birgitta Wöhrl
Graduate Schools > University of Bayreuth Graduate School
Faculties
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry > Former Professors
Graduate Schools
Language: German
Originates at UBT: Yes
URN: urn:nbn:de:bvb:703-epub-5246-3
Date Deposited: 11 Jan 2023 07:30
Last Modified: 11 Jan 2023 07:31
URI: https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/5246

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