Title data
Briese, Lars:
Strukturelle Untersuchungen der Lck-Domänen unique und SH3 und ihre Wechselwirkungen mit zellulären und viralen Proteinen.
Bayreuth
,
2002
(
Doctoral thesis,
2002
, University of Bayreuth, Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences)
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Abstract
In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die beiden amino-terminalen Domänen der Lymphocyten Spezifischen Kinase (unique- und SH3-Domäne, LckU3) mittels NMR-Spektroskopie in Lösung strukturell zu charakterisieren. Auf Basis dieser NMR-Untersuchungen war es möglich, die Wechselwirkungen von LckU3 mit verschiedenen Bindungspartnern auf atomarer Ebene zu verfolgen. Darüber hinaus wurden neue Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen dem HIV-1 Protein Nef und dem HIV Hauptrezeptor CD4 gewonnen. Die unique- und die SH3-Domäne der Lck wurden in E. coli exprimiert und anschließend gereinigt. Die Untersuchung von LckU3 mittels NMR-Spektroskopie zeigte, dass die unique-Domäne in wässriger Lösung unstrukturiert vorliegt. Für die SH3-Domäne wurde die dreidimensionale Struktur in Lösung mit hoher Präzision bestimmt. Mit Hilfe von 1H,15N-HSQC-Titrationsexperimenten konnten die Bindung eines durch Phagendisplay selektierten SH3-Liganden sowie die Interaktion von HIV-1 Nef mit der Lck SH3-Domäne nachgewiesen und diese charakterisiert werden. Ebenso wurde die zinkvermittelte Interaktion der Lck unique-Domäne mit der cytoplasmatischen CD4-Domäne gezeigt. Sowohl CD4 als auch die unique-Domäne binden spezifisch Zink mit einer Affinität, die eine optimale Regulation der Lck-CD4 Assoziation in der Zelle erlaubt. Mit Hilfe von Fluoreszenztitrationsmessungen wurde der KD der Lck-CD4 Interaktion auf 0,35 µM bestimmt. Darüber hinaus wurden experimentelle Bedingungen gefunden, die eine eingehende Charakterisierung des Lck-CD4 Komplexes ermöglichen werden. Die Untersuchung der Bindung von HIV-1 Nef an CD4 sowohl mit NMR- als auch fluoreszenzspektroskopischen Methoden zeigte, dass bislang unbeachtete Reste im N-terminalen Bereich des Nef-Proteins einen erheblichen Anteil an der CD4-Interaktion haben und die Affinität von Nef zu CD4 um etwa das 300fache erhöhen . Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, alle binären Interaktionen zwischen der Lymphocyten Spezifischen Kinase, dem Oberflächenrezeptor CD4 und dem HIV-1 Protein Nef eingehend zu untersuchen und zu charakterisieren. Da keine dieser Interaktionen kompetitiv sind, wurde die Existenz eines ternären Komplexes diskutiert.
Abstract in another language
In the present work, the two N-terminal domains of the lymphocyte specific kinase (unique- and SH3-domains, LckU3) were characterized structurally by NMR spectroscopy. Thus, it was possible to examine the interactions of LckU3 with various ligands on an atomic level. Moreover, this work resulted in new insights into the interactions of the HIV-1 protein Nef and the HIV main receptor CD4. Lck unique and SH3 domains were overexpressed in E. coli and subsequently purified. Using NMR spectroscopy, the unique domain was found to be unstructured in aqueous solution. A high resolution three-dimensional structure of the SH3-portion of the molecule could be determined. Binding of a phage display selected SH3 ligand and the interaction of HIV-1 Nef to the Lck SH3 domain could be demonstrated and were characterized by the use of 1H,15N-HSQC titration experiments. Likewise, the zinc mediated interaction of the Lck unique domain and the cytoplasmic CD4 domain was shown. CD4 as well as the unique domain bind zinc with an affinity which would allow an optimal Lck-CD4 association in the cell. Using fluorescence titration experiments, a KD value of 0,35 µM was determined for the association of the Lck-CD4 complex. Furthermore, experimental conditions were found which will enable a full characterization of the complex in the future. Applying nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy, it could be demonstrated that additional, so far disregarded residues in the N-terminal portion of HIV-1 Nef are important for CD4 binding. These residues increased the binding affinity 300-fold. In this work, all binary interactions of the lymphocyte specific kinase, the cell surface receptor CD4 and HIV-1 Nef were investigated and characterized. On the basis of these studies, the existence of a ternary complex has been discussed.
Further data
Item Type: | Doctoral thesis (No information) |
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Keywords: | Protein-Tyrosin-Kinasen; NMR-Spektroskopie; HIV; Strukturaufklärung; Lck; NMR-spectroscopy; HIV |
DDC Subjects: | 500 Science > 570 Life sciences, biology |
Institutions of the University: | Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Biology Faculties Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences |
Language: | German |
Originates at UBT: | Yes |
URN: | urn:nbn:de:bvb:703-opus-26 |
Date Deposited: | 26 Apr 2014 18:03 |
Last Modified: | 26 Apr 2014 18:03 |
URI: | https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/1030 |