Etablierung und Optimierung von in vivo- und in vitro-Systemen zur Erhöhung der Produktion sowie zur Stabilisierung der humanen Dopaminrezeptoren D2 und D3

Titelangaben

Boritzki, Vanessa:
Etablierung und Optimierung von in vivo- und in vitro-Systemen zur Erhöhung der Produktion sowie zur Stabilisierung der humanen Dopaminrezeptoren D2 und D3.
Bayreuth , 2020 . - V, 186 S.
( Dissertation, 2020 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Die humanen Dopaminrezeptoren D2 und D3 sind integrale Membranproteine und gehören zu den G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Beide Rezeptoren sind im zentralen Nervensystem lokalisiert und werden durch den endogenen Liganden Dopamin stimuliert. Veränderungen im dopaminergen System, wie beispielsweise ausbleibende Bildung des endogenen Liganden oder Mutationen in den Genen der Rezeptoren, können zu schwerwiegenden neurologischen Erkrankungen führen. Um die genauen molekularen Zusammenhänge zu verstehen und um Fehlregulationen ausgleichen zu können, ist es zwingend erforderlich, den Aktivierungsmechanismus der Rezeptoren aufzuklären und neue Medikamente zu entwickeln, die mit hoher Spezifität an die jeweiligen Rezeptor-Subtypen binden, um Nebenwirkungen auf ein Minimum zu reduzieren (Subtyp-Selektivität). Dafür werden strukturelle und biochemische Untersuchungen der beiden Dopaminrezeptoren in der aktiven Konformation benötigt. Die größte Herausforderung für die erforderlichen strukturbiologischen Analysen besteht darin, rekombinante Rezeptoren in ausreichenden Mengen (mg-Maßstab) herzustellen. Hierfür stehen verschiedene in vivo- und in vitro- Expressionssysteme zur Verfügung, welche im Rahmen dieser Arbeit für die beiden Dopaminrezeptoren D2 und D3 geprüft wurden. Der Fokus lag darauf, die Rezeptoren ohne Fusionsproteine, wie dem T4-Lysozym, in der dritten intrazellulären Schleife (third intracellular loop, ICL3) zu synthetisieren, da diese Fusionen die Kopplung mit dem G-Protein beeinträchtigen und die Rezeptoren im Zuge dessen die aktive Konformation nicht einnehmen können. Zu Beginn des Projekts war bereits bekannt, dass der wildtypische D3-Rezeptor in hohen Mengen in Insektenzellen synthetisiert werden kann, jedoch war unklar, ob er auch funktionell daraus gereinigt werden kann. Daher wurde versucht, den D3wt-Rezeptor aus Insektenzellen zu reinigen. Der Rezeptor wurde jedoch im Zuge der Reinigung proteolytisch abgebaut, wahrscheinlich durch einen Schnitt im ICL3, der ca. 25 % (~100 Aminosäuren) des Proteins ausmacht und vermutlich unstrukturiert ist. Darüber hinaus wurde die zellfreie Expression für den D3-Rezeptor getestet, da dieser im Gegensatz zum D2-Rezeptor noch nicht zellfrei hergestellt wurde. Basierend auf den Erfahrungen bezüglich der Reinigung aus Insektenzellen wurde der D3-Rezeptor modifiziert und unterschiedliche Rezeptorvarianten geprüft. Es wurden flexible Teile des D3-Rezeptors gekürzt (N-Terminus und ICL3), um ihn für strukturbiologische Untersuchungen wie Röntgenstrukturanalyse und Kernspinresonanzspektroskopie besser zugänglich zu machen und vor proteolytischem Abbau zu schützen. Außerdem wurden Cysteine gegen Alanin bzw. Serin ausgetauscht, um Fehlfaltung aufgrund unerwünschter Disulfid-Brücken zu reduzieren. Vor der zellfreien Expression wurden zunächst Nanodiscs hergestellt, um den Rezeptor in einer Lipidumgebung zu stabilisieren. Dafür wurde das membrane scaffold protein MSP1E3D1 in Escherichia coli (E. coli) produziert und gereinigt. Für die anschließende Assemblierung des MSP1E3D1 wurden unterschiedliche Phospholipide verwendet, wobei die Assemblierung mithilfe der Dialyse am erfolgreichsten war. Unter Zugabe der Nanodiscs gelang es, die hydrophoben D3-Rezeptorvarianten während der zellfreien Expression in Lösung zu bringen. Der Hauptteil der Arbeit beschäftigte sich damit, die Synthese des D2- und D3-Rezeptors in E. coli zu optimieren, um daraus Rezeptor im mg-Maßstab für strukturbiologische Untersuchungen reinigen zu können, der durch Agonisten und die Kopplung mit dem G-Protein aktiviert werden kann. Beide Rezeptoren wurden erfolgreich mit N- und C-terminalem Fusionsprotein hergestellt und waren im Radioligandenbindungstest in der Lage, den Liganden [3H]Spiperon zu binden. Aminosäuresubstitutionen führten beim D2-Rezeptor zu einer deutlich verbesserten Synthese, die es erlaubt, Rezeptor in hohen Mengen aus E. coli zu reinigen. Außerdem konnte für beide Rezeptoren gezeigt werden, dass eine Expression der Gene für 4h deutlich vielversprechender ist als die Expression über Nacht. Der erste Reinigungsschritt für die Rezeptoren, welcher die Isolation der Membranen aus E. coli beinhaltet, konnte ebenfalls erfolgreich durchgeführt werden. Abschließend wurde für die Dopaminrezeptoren D2 und D3 eine Strategie basierend auf gerichteter Evolution etabliert, mit welcher der Grundstein gelegt wurde, um die Synthese der rekombinanten Rezeptoren noch weiter zu steigern und um Rezeptorvarianten zu finden, die eine erhöhte Thermostabilität aufweisen.

Abstract in weiterer Sprache

The human dopamine receptors D2 and D3 are integral membrane proteins and belong to the G protein-coupled receptors (GPCRs). Both receptors are located in the central nervous system and are stimulated by the endogenous ligand dopamine. Changes in the dopaminergic system, such as the lack of formation of the endogenous ligand or mutations in the genes of the receptors, can lead to serious neurological diseases. In order to understand the exact molecular relations and to compensate for misregulation, it is absolutely necessary to elucidate the activation mechanism of the receptors and to develop new drugs that bind to the respective receptor subtypes with high specificity in order to reduce side effects to a minimum (subtype selectivity). This requires structural and biochemical investigations of the two dopamine receptors in the active conformation. The greatest challenge is to produce recombinant receptors in sufficient quantities (mg-scale) for structural biological analyses. For this purpose, different in vivo and in vitro expression systems are available, which have been tested in this work for the two dopamine receptors D2 and D3. One key aspect was the synthesis of the receptors without fusion proteins in the third intracellular loop (ICL3), such as T4 lysozyme, since these fusions interfere with G protein coupling and therefore the receptors cannot assume the active conformation. At the beginning of the project it was already known that the D3 wild-type receptor can be synthesized in high amounts in insect cells, but it was unclear whether it could also be functionally purified from them. Therefore, an attempt was made to purify the D3wt receptor from insect cells. However, the receptor was degraded by proteases during purification. Probably, the receptor was cut in the ICL3, which accounts for about 25% (~100 amino acids) of the protein and is supposed to be unstructured. In addition, cell-free expression was tested for the D3 receptor, since in contrast to the D2 receptor it has not yet been produced in vitro. Based on the experience with purification from insect cells, the D3 receptor was modified and different receptor variants were tested. Flexible parts of the D3 receptor were truncated (N-terminus and ICL3) to make the protein more accessible for structural studies such as X-ray and nuclear magnetic resonance spectroscopy and to protect it from proteolytic degradation. In addition, cysteines were exchanged for alanine and serine to reduce misfolding due to undesired disulfide bridges. Before carrying out cell-free expression, nanodiscs were prepared to stabilize the receptor in a lipid environment. The membrane scaffold protein MSP1E3D1 was produced and purified from Escherichia coli (E. coli). Afterwards, different phospholipids were used for the assembly of MSP1E3D1. It was shown that the assembly was most successful using dialysis. The use of nanodiscs allowed cell-free production of the hydrophobic D3 receptor variants in solution. The main part of the work dealt with the optimization of the synthesis of the D2 and D3 receptor in E. coli in order to purify receptor on a mg-scale for structural studies, which can be activated by agonists and coupling to G protein. Both receptors were produced successfully with N- and C-terminal fusion proteins and showed binding to the ligand [3H]spiperone in a radioligand binding assay. Substitution of amino acids led to a significantly improved synthesis of the D2 receptor, which allows the purification of receptor in large quantities from E. coli. Furthermore, it was shown for both receptors that expression of the genes for 4h is much more promising than overnight expression. The first purification step for the receptors, which involves isolating the membranes from E. coli, was also performed successfully. Finally, a strategy based on directed evolution was established for the two dopamine receptors in order to increase the synthesis of recombinant receptors further and to find receptor variants with increased thermostability.