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Kristallstruktur der Selen-abhängigen Nicotinat-Dehydrogenase aus Eubacterium barkeri

URN to cite this document: urn:nbn:de:bvb:703-opus-7146

Title data

Wagener, Nadine:
Kristallstruktur der Selen-abhängigen Nicotinat-Dehydrogenase aus Eubacterium barkeri.
Bayreuth , 2009
( Doctoral thesis, 2009 , University of Bayreuth, Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences)

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Abstract

Eubacterium barkeri ist ein gram-positives, anaerobes Bakterium, das zur Ordnung der Clostridien gehört. Es ist der einzige bekannte Organismus, der Nicotinat fermentativ zu Propionat, Acetat, CO2 und NH4+ abbauen kann. Initiert wird dieser Abbauweg durch eine Selen-abhängige Nicotinat-Dehydrogenase, die zur Familie der Molybdän-abhängigen Xanthin-Oxidoreduktasen gehört. Xanthin-Oxidoreduktasen sind große, meist dimere Moleküle die ihr Substrat unter gleichzeitiger Oxidation hydroxylieren. Katalysiert wird diese Reaktion durch einen charakteristischen Molybdän-Kofaktor, der im Verlauf der Reaktion als Hydrid-Akzeptor, Proton-Donor und Hydroxyl-Donor fungiert. Die Elektronen werden vom Molybdän aus über eine kurze Elektronentransport-Kette, bestehend aus zwei [2Fe2S]-Zentren sowie häufig einem FAD-Molekül, auf einen externen Elektronenakzeptor übertragen. Durch Wachstum auf Nicotinat-haltigem Medium wurde die NDH in E. barkeri exprimiert. Es wurden verschiedene Reinigungsstrategien entwickelt die, in Bezug auf Reinheit und Aktivität, den Anforderungen der jeweiligen Kristallisation angepasst waren. Die kurze Halbwertzeit des instabilen Enzyms konnte durch eine verkürzte Reinigung von wenigen Stunden auf mehrere Tage verlängert werden. Die Kristallisation des sauerstoffempfindlichen Enzyms erfolgte unter anaeroben Bedingungen, durch die Methode der Gasphasendiffusion im hängenden Tropfen. Die Struktur der NDH konnte bei 2,2 Å gelöst werden. Die NDH ist eine typische Xanthin-Oxidoreduktase mit einer dimeren Grundstruktur, sowie jeweils einer Molybdän- , Flavin- und Eisen-Schwefel-Untereinheit je Monomer. Weiter war es möglich, das Enzym in aktiver Form, d.h. mit Selen-haltigem Molybdän-Kofaktor zu kristallisieren und seine Struktur bei 2,5 Å zu lösen. Der Nachweis des Selens erfolgte unter Verwendung der anomalen Streuung des Selens am ESRF. Dadurch konnte nachgewiesen werden, dass das Selen als endständiger Ligand des Molybdäns eine äquivalente Position einnimmt wie Schwefel im Kofaktor anderer Xanthin-Oxidoreduktasen. Die NDH ist die erste Nicotinat-Dehydrogenase, sowie die einzige Xanthin-Oxidoreduktase mit endständigem Selenoliganden, die bisher kristallisiert werden konnte. Letztlich handelt es sich auch um die erste Kristallstruktur eines Enzyms, dessen katalytisch involviertes Selen nicht in Form von Selenocystein Bestandteil des Proteins ist.

Abstract in another language

Eubacterium barkeri is a gram-positive, anaerobic bacterium of the order Clostridiales. It is the only known organism that is able to ferment nicotinate to propionate, acetate, CO2 and NH4+. The first step of this pathway is catalysed by a selene-dependent nicotinate dehydrogenase, a member of the molybdenum-dependent xanthine oxidoreductases. Xanthine oxidoreductases are large, often dimeric molecules that hydroxylate their substrate under concomitant oxidation. The reaction is catalysed by a characteristic molybdenum cofactor that functions as hydride acceptor, proton donor and hydroxyl donor in the course of reaction. The electrons are transferred by a short electron transport chain, starting at the molybdenum cofactor followed by two [2Fe2S]-centers and commonly a FAD molecule, to an external electron acceptor. The oxygen sensitive enzyme was crystallized by vapour diffusion hanging drop under anaerobic conditions. The structure of NDH was solved at 2.2 Å. NDH is a typical xanthine oxidoreductase with a dimeric organisation, each monomer consisting of one molybdo-, one flavin- and one iron-sulfur cluster containing subunit. Further, the enzyme was crystallized with the selenium containing molybdenum cofactor still intact and its structure was solved at 2.5 Å. Selenium was detected by its anomalous dispersion at the ESRF. It could be shown that selenium is bound as a terminal ligand to molybdenum and occupies an equivalent position as the terminal sulfido ligand in the cofactor of different xanthine oxidases. NDH from Eubacterium barkeri is the first nicotinate dehydrogenase as well as the first xanthine oxidoreductase with a terminal seleno ligand that could be crystallised so far. It is the first crystal structure of an enzyme that contains selenium in the form of a nonselenocysteine ligand.

Further data

Item Type: Doctoral thesis (No information)
Keywords: Domäne <Kristallographie>; Enzym; Selen; Cofaktor; Clostridium barkeri; Oxidoreduktase; Nicotinat; Molybdän; protein crystallography; molybdenum; selenium; oxidoreductase; nicotinate
DDC Subjects: 500 Science > 540 Chemistry
Institutions of the University: Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences > Department of Chemistry
Faculties
Faculties > Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences
Language: German
Originates at UBT: Yes
URN: urn:nbn:de:bvb:703-opus-7146
Date Deposited: 25 Apr 2014 10:00
Last Modified: 25 Apr 2014 10:00
URI: https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/456

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