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Neue Ansätze zur Produktion Kollagen-basierter Biomaterialien

DOI zum Zitieren dieses Dokuments: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00004483
URN to cite this document: urn:nbn:de:bvb:703-epub-4483-3

Title data

Golser, Adrian V.:
Neue Ansätze zur Produktion Kollagen-basierter Biomaterialien.
Bayreuth , 2019 . - 89 P.
( Doctoral thesis, 2019 , University of Bayreuth, Faculty of Biology, Chemistry and Earth Sciences)
DOI: https://doi.org/10.15495/EPub_UBT_00004483

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Abstract

Kollagen ist ein zentraler Bestandteil der extrazellulären Matrix und damit eines der am häufigsten vorkommenden Proteine im Tierreich, welches somit maßgeblich für die Struktur, Form und Mechanik des darauf basierenden Gewebes verantwortlich ist. Die biomedizinische Verwendbarkeit von Kollagen wurde bereits früh erkannt, nachdem festgestellt wurde, dass sich gereinigte Kollagenfasern, die aus der Submucosa des Dünndarms von Tieren gewonnen wurden, als resorbierbares Nahtmaterial eignen, welches seither als Catgut bekannt ist. Trotz möglicher unerwünschter Nebenreaktionen, wie z.B. der Möglichkeit einer allergischen Reaktion auf derartige Xenotransplantate, wird Kollagen heutzutage in vielfältige Morphologien prozessiert und findet besonders als Barriere- und Füllsubstanz bei der Geweberekonstruktion Verwendung als Biomaterial. Im Zuge dieser Arbeit wurde deshalb versucht, den Anspruch eines rekombinanten Kollagens an das Expressionssystem besonders in Hinsicht auf die Notwendigkeit von Sekundärmodifikationen zu verringern. Als ein möglicher Kandidat in diesem Zusammenhang wurde das Muschelbyssuskollagen preColD gewählt und erfolgreich in P. pastoris produziert. Es konnte gezeigt werden, dass die Selbstassemblierung von preColD möglich ist, da flankierende Domänen vorhanden sind, die die Entstehung von Gelatine-artigen Netzwerken verhindern, indem sie eine Erstassemblierung ermöglichen, die als Keim für die Ausbildung einer korrekt gefalteten Kollagen-Tripelhelix dient. Diese Beobachtung konnte im Zuge einer zweiten Arbeit bestätigt werden, in der ein synthetisches (GPP)50-Polymer in E. coli rekombinant produziert wurde. Das so genannte eCol wurde am Aminoterminus mit einem redox-schaltbaren Foldon versehen, welches unter oxidierenden Bedingungen Cystin-Brücken ausbildet und damit zur Oligomerisierung der gelösten Monomere führt. Im Zuge von Schmelzpunktbestimmungen wurde der Einfluss der Foldon-Domäne auf das Assemblierungsverhalten der eCol-Konstrukte unterschiedlicher Länge untersucht und dabei festgestellt, dass eine derartige Domäne ausreichend ist, um eine Assemblierung von tripelhelikalem Kollagen unter physiologischen Bedingungen zu ermöglichen. Weiterhin wurde beobachtet, dass das gezeigte (GPP)n-basierte Polymer überraschend stabil ist und auch ohne das Vorhandensein von Hydroxyprolin Schmelzpunkte weit jenseits derer von natürlichem Kollagen aufweist. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Cytokompatibilität von eCol dahingehend gewährleistet ist, dass es im nativen Zustand keinerlei Interaktion mit Zelloberflächenrezeptoren wie z.B. Integrin zeigt und damit eine aus biologischer Sicht inerte Oberfläche bietet, an welche mehrere untersuchte Zelllinien nicht adhärierten. Wurde das langkettige eCol als Matrix für kurzkettige (GPP)n-Peptide genutzt, welche zusätzlich spezifische Adhäsionsmotive tragen, fand daran die Zelladhäsion statt. Es konnte also gezeigt werden, dass es durch rationales Design möglich ist, rekombinant produzierbare, kollagenartige Proteine herzustellen, die die Möglichkeit zur schaltbaren Selbstassemblierung besitzen und zusätzlich dazu genutzt werden können, gewünschte Funktionalitäten gezielt in das Protein einzubringen, wodurch rekombinante Kollagene in Zukunft gute Kandidaten für Anwendungen als Biomaterial sind.

Abstract in another language

Collagen is an important constituent of the extracellular matrix and therefore one of the most abundant proteins in the animal kingdom. It is largely responsible for the shape, structure and mechanical properties of the tissues it helps to form. The possible biomedical applications of collagen have been known since ancient times, with the most prominent example being absorbable suture materials called catgut, which is made from the cut and purified submucosa of sheep intestine. Even though there is a chance for unwanted immune reactions to such xenotransplants, such as allergic responses, collagen-based biomaterials for medical use have since been processed into a variety of morphologies and are currently most prominently applied as a barrier or filler material during reconstructive surgery. One of the goals of this thesis was therefore to reduce the requirements of the recombinant collagen towards the expression host, especially with regards to the necessity of secondary modifications. One candidate to fulfill this prerequisite was found with the mussel byssus protein preColD, which could be successfully produced in the yeast P. pastoris. It could be shown that the self-assembly of preColD was possible because of the presence of flanking domains that assembled before the collagen-like domain and thereby provided a nucleation site for the growth of single, correctly folded collagen triple-helix instead of an unstructured gelatin-like network. The same observation could be made when a synthetic (GPP)50-polymer was expressed in E. coli. The amino-terminus of this so called eCol protein was fitted with redox-switchable foldon domain that, under oxidizing conditions, would form cystein bridges between other eCol-monomers and thereby lead to the formation of oligomers. The influence of this foldon domain on the folding and assembly properties was investigated during melting-point determination experiments for eCol-constructs of varying lengths. It was found that the domain was sufficient to promote the formation of collagen-like secondary structures under physiological conditions. Furthermore, it could be shown that even without hydroxylation, (GPP)n-based polymers are remarkably stable and, depending on their length, can have melting points far beyond those of natural collagen. Furthermore, it could be shown that eCols are cytocompatible in that they do not show interaction with cell surface proteins such as integrins in their native state, thereby offering an inert surface that does not show adhesion for several tested cell types. However, when using a long-chain eCol as a matrix for short (GPP)n-peptides, specific functionalities such as adhesion motifs can be integrated into the structure and in the case of RGD-motifs, cell adhesion could be observed. In conclusion, this thesis shows that with rational design, it is possible to recombinantly produce collagen like proteins that contain features which allow a switchable self-assembly and furthermore possess the ability to quickly integrate specific functional groups, which should allow these recombinant collagens to be promising candidates for future biomaterials based thereon.

Further data

Item Type: Doctoral thesis (No information)
Keywords: collagen; silk; byssus; tissue replacement; biomaterials; preCol; engineered collagen
DDC Subjects: 500 Science > 570 Life sciences, biology
Institutions of the University: Graduate Schools > Bayreuth Graduate School of Mathematical and Natural Sciences (BayNAT)
Graduate Schools
Language: German
Originates at UBT: Yes
URN: urn:nbn:de:bvb:703-epub-4483-3
Date Deposited: 02 Oct 2019 09:19
Last Modified: 02 Oct 2019 09:40
URI: https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/4483

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