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Foamy Virus RNase H - Aktivität, Struktur und Funktion

URN zum Zitieren dieses Dokuments: urn:nbn:de:bvb:703-opus4-13239

Titelangaben

Leo, Berit:
Foamy Virus RNase H - Aktivität, Struktur und Funktion.
Bayreuth , 2013
( Dissertation, 2013 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Zusammenfassung Das für die Replikation des RNA-Genoms von Foamy Viren (FV) notwendige Enzym, die Protease-Reverse Transkriptase (PR-RT), beinhaltet die Protease-, die Polymerase- und RNase H-Domäne. Letztere ist für den Abbau der RNA im entstehenden RNA/DNA Hybrid verantwortlich. Während die FV PR-RT als Monomer vorliegt, besteht die HIV-1 RT aus einem p66/p51-Heterodimer. Erstaunlicherweise ist die isolierte HIV-1 RNase H im Vergleich zur z.B. E. coli oder separaten MoMLV RNase H nicht aktiv. Aus den Sequenzvergleichen verschiedener RNase H-Domänen ergibt sich, dass die Prototyp FV (PFV) RNase H im Gegensatz zur HIV-1 RNase H einen Sekundärstrukturbereich aufweist, bei dem es sich um die sogenannte C-Helix mit einer sich anschließenden basischen Schleife (basic protrusion) handelt. Da zu Beginn der Arbeit keine 3D-Struktur einer retroviralen RNase H mit basic protrusion bekannt war, sollte in dieser Arbeit die Struktur der PFV RNase H und die Funktion der basic protrusion bei der Substratbindung geklärt werden. Die Tertiärstruktur der PFV RNase H-Domäne konnte mit NMR-Spektroskopie gelöst werden. Somit war es möglich, die basic protrusion einschließlich der C-Helix zu identifizieren. Die isolierte RNase H-Domäne zeigte in fluoreszenzbasierten Tests sowie in qualitativen RNase H-Versuchen mit radioaktiv markiertem Substrat Aktivität. Um die Funktion der C-Helix und der sich anschließenden basischen Schleife bei der Substratbindung zu analysieren, wurden NMR-Titrationsexperimente durchgeführt. Dafür wurde die PFV RNase H-Domäne zunächst durch den Austausch der zwei katalytisch wichtigen Reste Aspartat 599 und Histidin 724 zu Asparagin inaktiviert (RNase H-(D599N-H724N)), um den Abbau des Substrates während der Messungen zu vermeiden. Die Auswertung von [15N, 1H]-HSQC- und [1H, 15N, 1H]-NOESY-HSQC-Spektren erbrachte eine Übereinstimmung der Tertiärstrukturen der RNase H-(D599N-H724N) mit der wt RNase H. Die NMR-Titrationsexperimente zeigten, dass die C-Helix in der PFV RNase H wie ein Lineal agiert, das die sich anschließende basische Schleife zum Substrat orientiert. Darüber hinaus besitzt die basic protrusion zusätzlich eine Reihe an positiv geladenen Resten, die gut lösungsmittelzugänglich sind und dadurch erste Kontakte mit dem Substrat ermöglichen. Damit bietet die basic protrusion eine Art Plattform für die Substratbindung. Der HIV-1 RNase H fehlt nicht nur die C-Helix, zusätzlich ist die sich anschließende Schleife vermutlich zu kurz, um das Substrat zu binden. Da diese Schleife außerdem nur über einen basischen Rest verfügt, ist wahrscheinlich auch die Gesamtaffinität dieses Bereichs für die Substratbindung zu gering. Strukturvergleiche der PFV RNase H mit der HIV-1 RT zeigen, dass die fehlende basic protrusion der HIV-1 RNase H durch eine Schleife aus der Verbindungs-Subdomäne der p66-Untereinheit kompensiert wird. Dieser Bereich könnte somit ein neuer Angriffspunkt für Inhibitoren in der antiretroviralen Therapie bei HIV 1 sein. Um zukünftig weitere Strukturanalysen mit der PR-RT bzw. mit einzelnen Domänen durchführen zu können, wurden in einem weiteren Projekt verschiedene N- und C-terminale Deletionsvarianten der PR-RT des Simian Foamy Virus hergestellt. Durch Aktivitätstests mit diesen Deletionsvarianten konnten die Abgrenzungen für die PR-, die Polymerase-, die RNase H-Domäne und die Verbindungs-Subdomäne in der PR-RT identifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass die Region H107-N143 C-terminal von der PR wichtig für die Funktion der Polymerase ist. Die Deletion der RNase H-Domäne und Verbindungs-Subdomäne führte zu einer drastischen Abnahme der Substrataffinität, Integrität und Polymerisationsfähigkeit des Enzyms. Trotzdem konnte eine minimale Polymerase-Domäne bestimmt werden (RT(107 454)), die ohne PR- und RNase H-Domäne sowie ohne die Verbindungs-Subdomäne in der Lage ist, zu polymerisieren. Für die Dimerisierung und damit Aktivierung der PR, die durch Bindung von zwei PR-RTs an das sog. PARM-Element (engl. protease activating RNA motif) auf der genomischen RNA geschieht, sind jedoch die RNase H-Domäne und die Verbindungs-Subdomäne unverzichtbar. Dadurch ist die RNase H nicht nur für die reverse Transkription essenziell; in FV stellt sie auch ein Regulationselement für die PR-Aktivierung dar und ist somit indirekt an der Prozessierung von Gag (Strukturproteine) und Pol (virale Enzyme) beteiligt.

Abstract in weiterer Sprache

Summary The foamy virus (FV) protease-reverse transcriptase (PR-RT), which is necessary for the replication of the viral RNA genome, consists of a protease, polymerase and RNase H domain. The latter is responsible for the degradation of the RNA in the emerging RNA/DNA-hybrid. While FV PR-RT is monomeric, HIV-1 RT consists of a p66/p51 heterodimer. Surprisingly, in comparison e.g. to the E. coli or the separate MoMLV RNase H, the isolated HIV 1 RNase H is not active. Sequence alignments of different RNase H domains show that in contrast to the HIV-1 RNase H the Prototype FV (PFV) RNase H possesses a secondary structure element that comprises the so-called C-helix followed by a basic loop (basic protrusion). At the beginning of my PhD thesis no 3D structure of a retroviral RNase H with a basic protrusion was available. Thus, the aim of my work was to resolve the 3D structure of the PFV RNase H and the function of the basic protrusion in substrate binding. The tertiary structure of the PFV RNase H could be solved by NMR spectroscopy and the basic protrusion including the C-helix could be identified. The isolated RNase H domain proved active by fluorescence based tests and qualitative RNase H assays with radioactively labelled substrate. To elucidate the function of the C-helix and the adjacent basic loop in substrate binding NMR titration experiments were performed. The catalytically important residues aspartate 599 and histidine 724 were exchanged for asparagines (RNase H-(D599N-H724N)), to inactivate the RNase H and thus avoid substrate degradation during NMR measurements. Analysis of [15N, 1H]-HSQC- and [1H, 15N, 1H]-NOESY-HSQC-spectra showed that the tertiary structure of the wt RNase H and of the RNase H-(D599N-H724N) were comparable. NMR titration experiments with the mutant PFV RNase H showed that the C-helix acts as a ruler to position the basic loop to the substrate. In addition, the basic protrusion possesses many positively charged residues which are well exposed to the solvent, thereby enabling first non-specific contacts with the substrate. Thus, the basic protrusion provides a platform for substrate binding. In contrast, HIV-1 RNase H lacks the C-helix and, in addition, the adjacent loop is probably too short to bind the substrate. Furthermore, since this loop harbours only one basic residue, the overall affinity to the substrate is expected to be rather low. However, structural comparison of PFV RNase H with HIV-1 RT showed that the lack of the basic protrusion in HIV 1 RNase H is compensated by a loop derived from the connection subdomain of the p66 subunit. Therefore, this region could be a new target for inhibitors against HIV-1. To further analyze the structure of PR-RT or of PR-RT domains in future projects, N- and C-terminal deletion variants of the PR-RT from Simian Foamy Virus have been constructed. Activity measurements of the deletion variants were used to identify the domain borders of the PR, polymerase and RNase H domains as well as the connection subdomain. The region H107-N143 proved important for the functionality of the polymerase. Deletion of the RNase H domain together with the connection subdomain resulted in a drastic decrease in substrate affinity, integrity and polymerization activity of the enzyme. It was possible to determine a minimal polymerase domain (RT(107-454)) lacking the PR and RNase H domains and the connection subdomain, which is still able to polymerize. Furthermore, we found that PR dimerization and activation via binding of at least two PR-RT molecules to the viral protease activating RNA motif (PARM) requires the presence of the full length PR-RT including the RNase H domain and the connection subdomain. Consequently, the RNase H is not only essential for reverse transcription. In FV it is also an important tool for regulating PR activation. Thus the RNase H is indirectly involved in the processing of the Gag (structural proteins) and Pol (viral enzymes) precursors.

Weitere Angaben

Publikationsform: Dissertation (Ohne Angabe)
Keywords: Struktur; Ribonuklease H; Retroviren; NMR
Themengebiete aus DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Institutionen der Universität: Graduierteneinrichtungen > BayNAT
Graduierteneinrichtungen
Sprache: Deutsch
Titel an der UBT entstanden: Ja
URN: urn:nbn:de:bvb:703-opus4-13239
Eingestellt am: 24 Apr 2014 14:43
Letzte Änderung: 11 Dec 2015 07:53
URI: https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/121