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RNA-Polymerase und Nus-Faktoren : Interaktionen als Schlüssel zur Regulation der bakteriellen Transkription

URN zum Zitieren dieses Dokuments: urn:nbn:de:bvb:703-epub-3027-7

Titelangaben

Drögemüller, Johanna:
RNA-Polymerase und Nus-Faktoren : Interaktionen als Schlüssel zur Regulation der bakteriellen Transkription.
Bayreuth , 2016 . - V, 173 S.
( Dissertation, 2015 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die Transkription ist der erste Schritt der Genexpression und damit ein zentraler Prozess in Zellen. Katalysiert wird sie durch das Enzym RNA-Polymerase (RNAP), das in Bakterien aus den Unterein-heiten α2, β, β‘ und ω besteht. Die Transkription ist durch eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren hoch reguliert, unter denen die N-utilisation substance (Nus) Faktoren eine wichtige Rolle spielen. Diese wurden bisher hauptsächlich im Modellorganismus Escherichia coli charakterisiert und die Unterschiede zu anderen Organismen sind kaum aufgeklärt. Auch über die strukturellen Grundlagen ihrer Interaktion mit der RNAP ist wenig bekannt, was jedoch entscheidend für das Verständnis der Regulation der Transkription auf atomarer Ebene ist. In dieser Arbeit wurde zunächst der Transkriptionsfaktor NusG des hyperthermophilen Bakteriums Thermotoga maritima (tmNusG) untersucht. Auf Grundlage struktureller Analysen, die eine stabile, für NusG-Proteine einzigartige, Interaktion der flexibel verbundenen N- und C-terminalen Domänen (NTD und CTD) zeigten, wurde die Dynamik der Interaktion charakterisiert. Da die Wechselwirkungen mit seinen Interaktionspartnern verhindert werden, ist tmNusG autoinhibiert. Durch gezielten Aminosäureaustausch war es möglich, die Autoinhibition aufzuheben. Im Gegensatz zu NusG aus E. coli und vielen anderen Bakterien verfügt tmNusG über eine zusätzliche, in die NTD insertierte Domäne, DII. Mittels Fluoreszenz-Anisotropie und NMR-Spektroskopie konnte für DII sowohl eine sequenzunabhängige Nukleinsäurebindung mit Präferenz für doppelsträngige DNA als auch eine Bindung an die RNAP nachgewiesen werden. Daher ist DII möglicherweise in die Rekrutierung des autoinhibierten tmNusGs zur RNAP involviert und könnte die Bindung von tmNusG an den Elongationskomplex durch RNAP- und DNA-Bindung stabilisieren. Obwohl die RNAP aus E. coli strukturell und mechanistisch bereits intensiv analysiert wurde, exis-tieren kaum Informationen über Intra- und Interdomänendynamiken oder transiente Interaktionen, die vorzugsweise mit NMR-Spektroskopie zugänglich sind. Zunächst wurde ein neues, effizientes Protokoll für die Assemblierung der aktiven RNAP aus den einzeln exprimierten Untereinheiten und deren Reinigung entwickelt. Dies erlaubt die Markierung einzelner Untereinheiten mit spezifischen NMR-Sonden. Mit dem deuterierten Enzym mit 1H,13C-markierten Methylgruppen von Ile, Leu und Val-Resten und dem deuterierten Enzym mit methylgruppenmarkierter β‘-Untereinheit konnten anschließend [1H,13C]-Korrelationsspektren gemessen und die Bindung von NusG-NTD beobachtet werden. Die isolierten Untereinheiten der RNAP konnten ebenfalls löslich und funktionell gereinigt werden. Es wurde eine Methode entwickelt, um die mit einem Transkriptionsfaktor interagierende RNAP-Untereinheit zu bestimmen. Nach Validierung mit NusG-NTD und zwei NusA-Domänen wurde mit diesem Ansatz die β-Untereinheit als Bindungspartner für NusE ermittelt. Zusätzlich wurde eine Methode entwickelt, um die Bindestelle der RNAP auf einem Transkriptionsfaktor mit NMR-Spektros-kopie zu identifizieren. Damit war es möglich, die bereits bekannten Bindestellen der RNAP auf NusG-NTD zu bestätigen und diejenigen auf NusE und NusA-NTD zu ermitteln. Die RNAP-Bindestelle auf NusE überlappt mit der Interaktionsfläche für NusG-CTD, wodurch eine kompetitive Bindung entsteht, die möglicherweise in der Antitermination der Transkription eine Rolle spielt. Mit der RNAP-Bindestelle von NusA-NTD konnte ein detailliertes Modell zur RNAP-Bindung erstellt werden. Dieser Ansatz kann allgemein auf Systeme übertragen werden, in denen ein supramolekularer Komplex mit einem kleineren Bindungspartner (< 30 kDa) interagiert.

Abstract in weiterer Sprache

Transcription is the first step in gene expression and thus a central process in cells. It is catalyzed by the enzyme RNA polymerase (RNAP) that consists of the subunits α2, β, β‘ and ω in bacteria. RNAP is highly regulated by a multitude of transcription factors among which the N-utilisation substance (Nus) factors play an important role. These Nus factors have been primarily analyzed in the model organism Escherichia coli and only little is known about differences to other organisms. Furthermore, the structural basis of their interaction with the RNAP is only poorly understood, which, however, is crucial for the complete understanding of transcription regulation in atomic detail. First, the transcription factor NusG from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima (tmNusG) was explored in this work. On the basis of structural studies that revealed a strong domain interaction between its flexibly connected N- and C-terminal domain (NTD and CTD), a feature unique among NusG proteins, the dynamic of this interaction was analyzed. As the interaction with its binding partners is prevented, tmNusG is autoinhibited. By directed amino acid exchange, it was possible to suppress the autoinhibition. In contrast to NusG from E. coli and many other bacteria, tmNusG contains the additional domain DII, which is integrated into the NTD. Fluorescence anisotro-py and NMR spectroscopy were used to demonstrate that DII binds nucleic acids with a preference for double stranded DNA and furthermore revealed its interactions with RNAP. Hence it was hypothesized that DII could be involved in the recruitment of the autoinhibited tmNusG to the RNAP. It could thus support the stabilization of the tmNusG:elongation complex interaction by binding to the RNAP and the DNA. Although the structure and mechanism of E. coli RNAP has been analyzed extensively, hardly anything is known about inter- and intradomain dynamics and transient interactions - information preferably accessible by NMR spectroscopy. Thus a new, efficient protocol for the assembly of core RNAP from its separately expressed subunits and the subsequent purification of the active enzyme was developed. The process allows the labeling of a specific subunit within the complete RNAP with specific NMR probes. [1H,13C] correlation spectra of deuterated RNAP in which the methyl groups of Ile, Leu and Val residues were 1H,13C labeled and RNAP with methyl group labeled β‘ subunit could be measured. Furthermore, the binding of NusG-NTD to the isolated, methyl group labeled β‘ subunit was observed. Additionally, the isolated RNAP subunits were purified solubly and functionally and a method was developed to identify the RNAP subunit to which a certain transcription factor binds. Having validated this approach with NusG-NTD and two NusA domains, the β subunit was deter-mined to interact with NusE. We further established a method to identify the RNAP binding surface on a transcription factor by NMR spectroscopy. In this way, we confirmed the known RNAP binding sites on NusG-NTD and determined those on NusA-NTD and NusE. The RNAP binding site on NusE overlaps with its interaction surface for NusG-CTD and the resulting competitive binding might play a role in transcription antitermination. The identification of the RNAP binding surface of NusA-NTD allowed the proposal of a detailed model of how NusA-NTD interacts with RNAP. This approach can be transferred to any system in which a supramolecular complex contacts a smaller binding partner (< 30 kDa).

Weitere Angaben

Publikationsform: Dissertation (Ohne Angabe)
Keywords: Transkription; RNA-Polymerase; Nus-Faktoren; NMR; Proteininteraktionen; Proteinreinigung; Thermotoga maritima; E. coli; Autoinhibition; Regulation der Transkription
Themengebiete aus DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften; Biologie
Institutionen der Universität: Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften > Fachgruppe Chemie > Lehrstuhl Biopolymere > Lehrstuhl Biopolymere - Univ.-Prof. Dr. Paul Rösch
Graduierteneinrichtungen > University of Bayreuth Graduate School
Fakultäten
Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften
Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften > Fachgruppe Chemie
Fakultäten > Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften > Fachgruppe Chemie > Lehrstuhl Biopolymere
Graduierteneinrichtungen
Sprache: Deutsch
Titel an der UBT entstanden: Ja
URN: urn:nbn:de:bvb:703-epub-3027-7
Eingestellt am: 07 Nov 2016 12:00
Letzte Änderung: 07 Nov 2016 12:00
URI: https://epub.uni-bayreuth.de/id/eprint/3027